Тест-набір для непрямого напівкількісного імунофлуоресцентного виявлення антинуклеарних антитіл ANA HEp2 у плазмі або сироватці собаки

MegaFLUO^® ANA HEp2 містить:

• 10 предметних стекол, з клітинами ANA HEp2
• 1 флакон-крапельниця з 3,0 мл кон’югату FITC IgG собак
• 1 флакон-крапельниця з позитивним контролем 0,5 мл
• 1 флакон-крапельниця з негативним контролем 0,5 мл
• 1 флакон-крапельниця з середовищем 3,0 мл
• 1 інструкція з використання системи ANA HEp2

ЗРАЗОК:

Сироватка або плазма

ЗБЕРІГАННЯ

• Температура зберігання тест-набору +2-8 °C
• Термін придатності: 12 місяців з моменту виготовлення

НЕОБХІДНІ МАТЕРІАЛ, ЯКІ НЕ НАДАЮТЬСЯ З ТЕСТ НАБОРОМ

PBS (фосфатно-сольовий буфер) pH 7,2-7,4, ємність для буфера, пробірки для розведень сироватки, мікропіпетки, покривні скельця 24 x 50 мм, флуоресцентний мікроскоп із системою фільтрів для FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат, збудження, при хвилях 465-495 нм, бар’єрний фільтр 515-555 нм) та 400-х магнітурою, інкубатор 37 °C, камера для предметних стекол.

ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ

Покупець бере на себе усі ризики, пов’язані з роботою цього продукту. Виробник не несе відповідальності за непрямі, спеціальні або непрямі збитки будь-якого виду, спричинені використанням цього продукту.

2. ПРИНЦИП ТЕСТУ

Собачу сироватку розводять у «PBS» (рН 7,2-7,4) та наносять у лунки на предметному стеклі, щоб провести реакцію антиген-антитіло при 37 °C. При подальшому промиванні «PBS» незв’язані неспецифічні білки сироватки змиваються. На наступному етапі додається кон’югат «FLUO FITC», IgG собаки помічені флуорецеїном, який зв’язується з комплексами антиген-антитіло. Після 30 хвилин інкубації, незв’язаний кон’югат змивають «PBS». Нарешті, у лунки додають середовище та накривають покривним склом. Оцінка проводиться за допомогою флуоресцентного мікроскопа (система фільтрів для «FITC») із магнітурою 400x.

3. ЗАПОБІЖНІ ЗАХОДИ

• Переконайтеся, що компоненти тест-набору належать до конкретного пацієнта
• Використовуйте новий наконечник піпетки для кожного зразка або розведення.
• Кон’югат світлочутливий та чутливий до температури, тому його слід зберігати у темряві при температурі 2-8 °С.
• Кон’югат містить барвник Еванс синій, який є потенційним канцерогеном. Уникайте потрапляння в організм та контакту зі шкірою.
• Матеріал зразка та предметні стекла слід розглядати як потенційно інфекційні, тому утилізувати зразки та компоненти набору необхідно дотримуючись усіх правил безпеки.

4. ВАЖЛИВА ДОДАТКОВА ІНФОРМАЦІЯ

Інтерпретація результатів тесту завжди повинна ґрунтуватися на анамнестичних, особистих клінічних даних паціента та додаткових лабораторних дослідженнях.
Зауважте, що інтерпретація результатів тесту залежить від спостережуваної моделі, титру аутоантитіл та віку собаки.

5. ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

1. На момент застосування, компоненти тест-набору (окрім кон’югату!) та досліджувані сироватки повинні бути кімнатної температуру.
2. Приготуйте відповідні розведення сироваток(наприклад, 1:50 та 1:100) з «PBS», які підлягають тестуванню. Для позитивно виявленних сироваток, під час попереднього тесту, рекомендується підготувати серійні подвійні розведення «PBS» для визначення кінцевого титру (= найбільше розведення, яке все ще є позитивним).
3. Вийміть предметні стекла з пакета, помістить їх у камеру для предметних стекол. Нанесіть по 1 краплі (20 мкл) позитивного та негативного контролю на кожне предметне скло в окремі лунки з антигеном. Додайте піпеткою 20 мкл кожного розведення сироватки в окремі лунки з антигеном (рис.1). Лунки з антигеном повині були повністю покриті.
4. Інкубуйте протягом 30 хвилин при 37 °C.
5. Етап промивання: обережно видаліть залишки сироватки з предметних стекол та похитуйте предметні стекла у «PBS» протягом 5 хвилин. Повторюйте цей крок ще 5 хвилин зі свіжим «PBS». Промийте предметні стекла дистильованою водою. Акуратно злийте воду що залишилася, з предметних стекол, якщо необхідно, висушіть тефлонову маску між лунками абсорбуючим папером або ватними паличками. Однак не допускайте висихання лунки з антигеном!

Якщо Ви використовуєте промивальну пляшку, не фокусуйте струмінь безпосередньо на лунки з антигеном!

6. Помістіть предметні стекла назад у камеру для предметних стекол та негайно додайте по 1 краплі кон’югату «FLUO FITC» IgG собак у кожну використану лунку (рис.2). Переконайтесь, що лунки з антигеном повністю покриті.
7. Інкубуйте 30 хвилин при 37°C у темному місці для захисту світлочутливого кон’югату.
8. Повторіть етап промивання, як описано у кроці 5.
9. Додайте кілька крапель середовища «Mounting Medium» на покривні скельця та обережно нанесіть їх на предметні стекла. Намагайтеся видалити всі можливі бульбашки.
10. За допомогою флуоресцентного мікроскопа при 400-кратному збільшенні (рис.3), порівняйте кожну лунку з картиною флуоресценції, що спостерігається у позитивному та негативному контролях. Проаналізуйте результат тестування.
11. Запечатані предметні стекла можна зберігати при температурі 2-8 °C у темряві до 7 днів.

6. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ТЕСТУ

Для оцінки результатів необхідний флуоресцентний мікроскоп із системою фільтрів для «FITC» (довжина хвилі збудження 465-495 нм, бар’єрний фільтр 515-555 нм) та 400-х магнітурою.
Картина флуоресценції (форма, щільність тощо) негативного та позитивного контролю розглядається як еталонна картина. Зразки реакційної здатності, відмінні від тих, що спостерігаються у Контролях, повинні вважатися неспецифічними, що означає – негативні!
Позитивна картина флуоресценції > 1:50
Помітна прозора жовто-зелена флуоресценція.
Позитивна реакція може демонструвати різні моделі ядерної та/або цитоплазматичної флуоресценції зеленого яблука, але будь-яку модель флуоресценції зеленого яблука, що спостерігається при розведенні 1:50, слід називати позитивною.
«Гомогенна картина»: розглядається як однорідна або дифузна зелена флуоресценція всього ядра через аутоантитіла до нативних гістонів ДНК та/або DNP (дезоксирибонуклеопротеїну). Хромосоми мітотичної клітини (клітини, що діляться) є важливими індикаторами однорідного малюнка, оскільки вони фарбуються у вигляді мас неправильної форми з більш інтенсивним забарвленими зовнішних країв.
«Рябчастий візерунок» (найпоширеніший)! Клітини, які не поділені (немітотичні), будуть демонструвати однорідні «справжні крапчасті» зелені флуоресцентні паттерни, які можна побачити у сироватках із центромерними антитілами. Хромосомна область мітотичних клітин не буде забарвлена; цитоплазма – кілька цяточок.
«Ядерний малюнок»: розглядається як однорідне, скупчене або крапчасте забарвлення ядерця, часто пов’язане з тьмяною однорідною флуоресценцією решти ядерця. У мітотичних клітинах хромосоми будуть негативними.
«Периферичний малюнок»: розглядається як переважне фарбування периферії ядерець.
Гранична картина флуоресценції 1:25
Помітна слабка жовто-зелена флуоресценція (1+).
Негативна картина флуоресценції < 1:25
Жовто-зеленої флуоресценції не помітна.