Слайди для непрямої напівкількісної імунофлюоресценції антитіл проти Rickettsia conorii у плазмі або сироватці собаки

MegaFLUO^® RICKETTSIA conorii містить:

• 10 предметних стекол, з клітинами Rickettsia conorii
• 1 флакон-крапельниця з 3,0 мл кон’югату ФІТЦ IgG кота
• 1 флакон-крапельниця з позитивним контролем 0,5 мл
• 1 флакон-крапельниця з негативним контролем 0,5 мл
• 1 флакон-крапельниця з середовищем 3,0 мл
• інструкція із застосування

ЗРАЗОК

Сироватка або плазма

ЗБЕРІГАННЯ

• Температура зберігання всього тест-набору +2 – 8°C
• Термін придатності: 12 місяців з моменту виготовлення

НЕОБХІДНІ МАТЕРІАЛ, ЯКІ НЕ НАДАЮТЬСЯ З ТЕСТ НАБОРОМ

PBS (фосфатний буфер з фізіологічним розчином) pH 7,2-7,4, ємність для PBS, пробірки для розведень сироватки, мікропіпетки, покривні скельця 24 x 50 мм, флуоресцентний мікроскоп із системою фільтрів для ФІТЦ (флуоресцеїн ізотіоціанат, збудження, при хвилях 465-495, бар’єрний фільтр 515-555) та 400-кратному збільшенню, інкубатор 37 °C, камера для предметних стекол.

2. ПРИНЦИП ТЕСТУ

Сироватку собаки розводять у «PBS» (рН 7,2-7,4) та наносять у лунки на предметному стеклі, щоб провести реакцію антиген-антитіло при 37 °C. При подальшому промиванні «PBS» незв’язані неспецифічні білки сироватки змиваються. На наступному етапі додається кон’югат «FLUO FITC», помічений флуорецеїном, IgG собаки, який зв’язується з комплексами антиген-антитіло. Після 30 хвилин інкубації, незв’язаний кон’югат змивають PBS. Нарешті, у лунки додають середовище та накривають покривним склом. Оцінка проводиться за допомогою флуоресцентного мікроскопа (система фільтрів для «FITC») із магнітурою 400x.

3. ЗАПОБІЖНІ ЗАХОДИ

• Переконайтеся, що компоненти тест-набору належать до конкретного пацієнта
• Використовуйте новий наконечник піпетки для кожного зразка або розведення.
• Кон’югат світлочутливий та чутливий до температури, тому його слід зберігати у темряві при температурі 2-8 °С.
• Кон’югат містить барвник синій Еванса, який є потенційно канцерогенним. Уникайте потрапляння в організм та контакту зі шкірою
• Матеріал зразка та предметні стекла слід розглядати як потенційно інфекційні, тому утилізувати зразки та компоненти набору необхідно дотримуючись усіх правил безпеки.

4. ВАЖЛИВА ДОДАТКОВА ІНФОРМАЦІЯ

Серорозповсюдженість:

Граничний показник може змінюватися залежно від регіону та походження зразка (залежно від поширеності та від стану ендемічності). Тому для кожної лабораторії рекомендується визначати індивідуальне обмеження.

Гостру інфекцію (збільшення титру у 2-4 рази: «сероконверсія») можна визначити лише шляхом визначення титру у поєднаній сироватці (2 зразки інтервалом у 2-3 тижні).

Інтерпретація результатів тесту завжди повинна ґрунтуватися на анамнезі, клінічних даних та лабораторних тестах.

 Можливі перехресні реакції

Rickettsia conorii є членом «групи плямистої лихоманки». Перехресні реакції з іншими членами цієї групи (наприклад, R. raoultii, R. massiliae, R. rickettsii, R. akari, R. australis, R. sibirica та іншими) відрізняються.

Перехресні реакції з представниками «групи лихоманки висипного тифу» набагато менш чіткі, причому титри у 8-32 рази нижчі, ніж у інфікованих видів.

5. ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

1. На момент застосування, компоненти тест-набору (окрім кон’югату!) та досліджувані сироватки повинні бути кімнатної температуру.
2. Приготуйте відповідні розведення (наприклад, 1:64 та 1:128) з «PBS» для сироваток, які підлягають тестуванню. Для позитивно виявленних сироваток, під час попереднього тесту, рекомендується підготувати серійні подвійні розведення «PBS» для визначення титру кінцевої точки (= найбільше розведення, яке все ще є позитивним).
3. Вийміть предметні стекла з пакета та помістить їх у камеру для предметних стекол. Нанесіть по 1 краплі (20 мкл) позитивного та негативного контролю на кожне предметне скло в окремі лунки з антигеном. Додайте піпеткою 20 мкл кожного розведення сироватки в окремі лунки з антигеном (fig.1). Лунки з антигеном повині були повністю покриті.
4. Інкубуйте протягом 30 хвилин при 37 °C.
5. Етап промивання: обережно видаліть залишки сироватки з предметних стекол та похитуйте предметні стекла у «PBS» протягом 5 хвилин. Повторюйте цей крок ще 5 хвилин зі свіжим «PBS». Промийте предметні стекла дистильованою водою. Акуратно злийте воду, що залишилася, з предметних стекол, якщо необхідно, висушіть тефлонову маску між лунками абсорбуючим папером або ватними паличками. Однак не допускайте висихання лунки з антигеном!

Якщо Ви використовуєте промивальну пляшку, не фокусуйте струмінь безпосередньо на лунки з антигеном!

6. Помістіть предметні стекла назад у камеру для предметних стекол та негайно додайте по 1 краплі кон’югату «FLUO FITC» IgG у кожну використану лунку (fig.2). Подбайте про те, щоб лунки з антигеном були повністю покриті.
7. Інкубуйте 30 хвилин при 37°C та у темному місці для захисту світлочутливого кон’югату.
8. Повторіть етап промивання, як описано у кроці 5.
9. Додайте кілька крапель середовища «Mounting Medium» на покривні скельця та обережно нанесіть їх на предметні стекла. Намагайтеся видалити всі можливі бульбашки.
10. За допомогою флуоресцентного мікроскопа при 400-кратному збільшенні (fig.3), порівняйте кожну лунку з картиною флуоресценції, що спостерігається у позитивному та негативному контролях. Проаналізуйте результат тестування.
11. Запечатані предметні стекла можна зберігати при температурі 2-8 °C у темряві до 7 днів.

6. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ТЕСТУ

Для оцінки результатів необхідний флуоресцентний мікроскоп із системою фільтрів для «FITC» (довжина хвилі збудження 465-495, бар’єрний фільтр 515-555) та 400-кратним збільшенням.

Картина флуоресценції (форма, щільність тощо) негативного та позитивного контролю розглядається як еталонна картина. Зразки реакційної здатності, відмінні від тих, що спостерігаються у Контролях, повинні вважатися неспецифічними, що означає – негативні!

 Позитивна картина флуоресценції ≥ 1:80

Позитивна реакція проявляється у вигляді яскравої, різкої жовто-зеленої флюоресценції плеоморфної палички або коккобацилової форми у цитоплазмі клітини.

Рекомендується подальше розведення позитивних зразків для визначення титру кінцевої точки (= найвище розведення, яке все ще є позитивним). Картина флуоресценції Cut-off / рекомендоване відсічення Cut-off 1:80

Бактерії у цитоплазмі інфікованих клітин мають слабку (1+) жовто-зелену флуоресценцію.

Негативна картина флуоресценції < 1:80

У клітинах немає флуоресцентних бактерій.