Набір для екстракції вірусної ДНК/РНК з тампона /слини на магнітних кульках, спеціально розроблений для KingFisher та інших апаратів екстракції нуклеїнових кислот.

Екстракція з: плазми, неклітинних рідин організму та інфікованих тканин. Набір використовує технологію екстракції на магнітних частках (суперпарамагнетизм), яка мінімізує ризик перехресного забруднення. Час роботи становить 50 хвилин.

Компоненти набору:

Реагент	Кількість	Опис
Буфер MVL	45 мл	Процес лізису
Буфер MB	25 мл	Процес зв’язування з магнітними частками
Буфер MW1	55 мл	Видаляє білки
«Магнісфер»	5,2 мл	Адсорбує нуклеїнову кислоту
ПЛР вода	15 мл	Без РНК/ДНК
Носій РНК	450 мкл	Вловлює залишки нуклеїнової кислот
Протеіназа К	1 мл х 2	Лізис білків

 

Умови зберігання:

Зберігайте РНК-носій та Протеїназу K при -20°C,

«Магнісфер» та ПЛР воду при 2-8°C, інші при кімнатній температурі (15-25°C).

Транспортуйте при кімнатній температурі.

Примітки

1. Приготуйте наконечники для піпеток, центрифужні пробірки 1,5 мл без РНКази, центрифугу тощо.
2. Дотримуйтесь правил безпеки.
3. Уникайте повторного заморожування-розморожування зразків. Цє призводить до деградації вірусної РНК.
4. Усі процедури, якщо не зазначено, проводять при кімнатній температурі (15-25°C).
5. Використовуючи цей набір, надягайте лабораторний халат, одноразові латексні рукавички, одноразові маски та використовуйте витратні матеріали без РНКази, щоб максимально уникнути забрудненню/контамінації.
6. Будь ласка, перевірте, чи є кристалічні осадки в буфері MVL. Якщо випадає кристалічний осад, нагрійте до 37°C, поки осад не розчиниться. Перед використанням добре перемішайте.

Перед використанням:

Додайте 55 мл безводного етанолу до буфера MW1, зберігайте при кімнатній температурі.

Додайте 58 мл ізопропанолу до буфера MB, зберігайте при кімнатній температурі.

Приготуйте 75% розчин етанолу.

 

Протокол A: Мануальний режим

1. Вірусний лізис. Для різних зразків слід застосовувати різні протоколи лізису, а саме:

• Лізис вірусу в плазмі, сироватці, без клітинних рідинах організму та вірусному вихідному розчині: приготуйте 10-200 мкл плазми, сироватки, без клітинних рідин організму або вірусного вихідного розчину. Якщо початкова кількість менше 200 мкл, додайте до 200 мкл розчин PBS або ПЛР-воду.
• Лізіс тканин, інфікованих вірусом: підготуйте 10 мг уражених вірусом тканин для розтирання у рідкому азотом та додайте 200 мкл розчину PBS або DEPC-води до розмелених тканин.
• Мазок з горла (з консервуючим розчином): перемішуйте на вортексі протягом 1 хв, візьміть 200 мкл.
• Тампон з горла (сухий): додайте 300 мкл буфера MVL та 10 мкл Протеїнази К, перемішайте на вортексі протягом 15 секунд. Інкубуйте при 56°C протягом 10 хв, центрифугуйте на найвищій швидкості протягом 1 хв. Супернатант: 200 мкл та додати РНК-носія: 2 мкл. Продовжіть з Кроку № 4.

2. Додайте 200 мкл буфера MVL, 10 мкл Протеїнази К та 2 мкл РНК-носія, перемішайте на вортексі 15 секунд.
3. Інкубуйте при 56°C протягом 10 хв.
4. Додайте 400 мкл буфера MB та 25 мкл «Магнісфер» до суміші, добре перемішайте. Дайте постояти 3-5 хвилин.
5. Перенесіть суміш на магнітну роздільну стійку та дайте постояти 3-5 хвилин. Обережно видаліть усі розчини.
6. Додайте 500 мкл буфера MW1. Перемішуйте на вортексі 15 секунд. Перенесіть у нову пробірку.
7. Перенесіть суміш на магнітну роздільну стійку та дайте постояти 2 хвилини. Обережно видаліть усі розчини.
8. Додайте 600 мкл 75% етанолу та перемішуйте суміш протягом 15 сек.
9. Перенесіть суміш на магнітну роздільну стійку та дайте постояти 2 хвилини. Обережно видаліть усі розчини.
10. Повторіть Кроки 7-9 один раз.
11. Центрифугуйте, щоб зібрати краплі зі стінки пробірки. Перенесіть у стійку магнітного розділення та обережно видаліть усі розчини.
12. Висушування на повітрі 7-10 хв.
13. Додайте 30~50 мкл DEPC-води, розмішайте на вортексі, щоб розсіяти магнітні кульки. Дати постояти 3-5 хв, протягом яких 2 рази похитнути, щоб прискорити розчинення нуклеїнової кислоти.
14. Перенесіть на стійку магнітної сепарації та дайте постояти 3 хв. Перенесіть розчин нуклеїнової кислоти у нову центрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл.