MegaELISA® EHRLICHIA canis – імуноферментний аналіз для якісного виявлення IgG проти Ehrlichia canis у плазмі або сироватці собаки.

Моноцитарний ерліхіоз собак (МЕС) викликається рикетсіями Ehrlichia canis, які зазвичай, передаються коричневим собачим кліщем (Rhipicephalus sanguineus). Ehrlichia canis зустрічається в багатьох частинах світу, особливо в районі Середземного моря, а також у Швейцарії та частково Німеччині. Ерліхіоз часто зустрічається у собак, але у людей рідко.

Концентрація специфічних антитіл різко зростає через 2-3 тижні після зараження. Підвищення титру антитіл у чотири рази з інтервалом у два тижні (сероконверсія) є ознакою гострої інфекції. У гострій стадії у собаки проявляється апатія, анорексія, лихоманка та лімфаденіт. У субклінічній фазі клінічні симптоми відсутні, але присутні не типові лабораторні результати ерліхіозу, такі як гіперглобулінемія та тромбоцитопенія. У тварин хронічної фази спостерігаються незначні до загрозливих для життя симптоми: спонтанні кровотечі, неврологічні розлади, анемія, сильна втрата ваги, а також спленомегалія та гепатомегалія. Відомо, що непряме виявлення антитіл є важливим діагностичним інструментом для діагностики “МЕС”, крім клінічних симптомів, історії хвороби (поїздка за кордон) та прямого виявлення антигену.

MegaELISA® EHRLICHIA canis тест система використовує високоспецифічні антигени для швидкого та надійного виявлення антитіл проти Ehrlichia canis у плазмі або сироватці крові собак.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® ANAPLASMA phagocytophilum – це якісний імунологічний аналіз для виявлення IgG проти Ehrlichia canis за принципом «сендвіча».

Специфічні антигени Ehrlichia canis зв’язуються з поверхнею лунки в ІФА планшеті. Розведені плазми або сироватки собаки, а також контролі інкубують на першому етапі при кімнатній температурі (20–25 °C) в лунках ІФА планшета. Після етапу промивання додають кон’югат IgG, мічений пероксидазою хрону, та інкубують при кімнатній температурі (20–25 °C). Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидину [TMБ]) у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює безбарвний розчин у лунках ІФА планшета на блакитний. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Згасання пропорційне концентрації антитіл IgG, специфічних до Ehrlichia, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте лише зразки плазми чи сироватки собак.
• Перед використанням добре перемішайте матеріал зразка.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів. Зразки плазми або сироватки можна брати на аліквоти та постійно зберігати при мінімум –20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• Не нагрівайте інактивацію!
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину (50 мл) концентрату промивного буфера з 9 частинами (450 мл) дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати його при кімнатній температурі (15–25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:101

 Зразки для тестування розводять 1:101 буфером для розведення зразків (SDB, наприклад, 5 мкл зразка + 500 мкл SDB).

• Добре гомогенізуйте зразок та буферну суміш (SBM) (повторіть змішування піпеткою або на «вортекс»)
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції, SBM має бути вільним від частинок! Щоб гарантувати це, відцентрифугуйте SBM при 5000 об/хв протягом 5 хвилин.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

 Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.

• Перед початком розташування зразків пацієнта та стандартів/контролів у планшеті для мікротитрування необхідно визначити на аркуші для результатів, що постачається разом із набором. Рекомендується принаймні дублювати.
• При кожному піпетуванні використовуйте чисті одноразові наконечники для піпеток.

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

 Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.

• Додати 50 мкл
• позитивного контролю
• негативного контролю
• нерозведеного у SBM зразка

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

Залиште одну лунку порожньою для бланк субстрату.

• Обережно струсіть ІФА планшет, накрийте його та інкубуйте 60±5 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 4 рази 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю злийте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.
• Перед останнім постукуванням подбайте про підготовку реагенту для наступного етапу піпетування

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції!
• Для досягнення оптимальних результатів промивання використовуйте принаймні 300 мкл промивного буфера на одну лунку.
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
  • Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл кон’югату в кожну лунку стрип-смужки,окрім лунки для Бланк Субстрату.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

Промийте, як вказано в пункті 8.2.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату (TMБ) у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C і в темряві).
• Додайте 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку стрип-смужки в такому ж порядку та з такою ж швидкістю, як для розчину субстрату ТМБ.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується додаткове вимірювання на референційній довжині хвилі 620 нм.
• Налаштуйте пристрій для зчитування ІФА планшетів на нуль за допомогою бланка субстрату. Якщо через технічні причини ІФА зчитувач не можна налаштувати на нуль за допомогою лунки для субстрату, щоб отримати надійні результати, відніміть значення екстинкції цієї лунки від усіх інших значень вимірювання.
• Якщо було зроблено дублікати або багаторазові визначення, обчисліть середнє значення поглинання.

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити чорнуваті осади розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад 1+1. Потім розведіть зразок 1:101 буфером для розведення зразка та помножте результати в «Мегакор Одиниця»* на 2.

 

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

СТАБІЛЬНІСТЬ РЕАГЕНТУ – ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні контрольні значення:

• Позитивний контроль 0,6 < Екстинкція < 2,0
• Негативний контролю Екстинкція < 0,1
• Субстрат Екстинкція < 0,1

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

 РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

 Значення відсікання: 0,180

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

 Позитивний результат тесту

Процентне значення зразка перевищує 10 % але менше за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10% вище і нижче значення відсікання. Якщо повторний тест через 2–4 тижні з новим зразком також є граничним, тоді зразок слід оцінити як негативний.

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• Бактеріальне забруднення або повторювані цикли заморожування-розморожування зразка можуть вплинути на значення екстинкції.
• Діагноз інфекційного захворювання не можна встановлювати на підставі одного результату дослідження. Точний діагноз повинен брати до уваги клінічний анамнез, симптоматику, а також серологічні дані.

ЗАХОДИ БЕЗПЕКИ ТА ЗАСТЕРЕЖЕННЯ

• Вдягніть захисний одяг (одноразові рукавички) та вимийте руки після завершення процедури тестування.
• Не можна їсти і пити під час тестування.
• Зразок матеріалу та контролі слід розглядати як потенційно інфекційні та утилізувати відповідно разом із використаними компонентами тест-набору.
• Не використовуйте реагенти інших виробників разом з реагентами цього тест-набору.
• Не змішуйте реагенти з різними номерами партій.
• Не міняйте ковпачки окремих реагентів між собою.
• Закрийте флакони одразу після використання, щоб уникнути випаровування та мікробного забруднення.
• Після першого відкриття флакони з реагентами необхідно перевірити на наявність мікробного забруднення перед повторним використанням.
• Промивний буфер, контролі та субстрат містять 0,045 % Proclin® 300 як консервант.
• Розчин субстрату містить перекис водню. Уникайте контакту з очима, шкірою.
• Стоп розчин містить 0,2 М кислоти. Ккислота подразнює очі та шкіру.

При попаданні в очі ретельно промити водою та звернутися до лікаря! Тримайте в недоступному для дітей місці.

• УВАГА: Рідкі відходи, що містять стоп-розчин, необхідно нейтралізувати перед додаванням їх у розчин гіпохлориту!
• Використовуйте лише чисті наконечники піпеток, дозатор і лабораторний матеріал.
• Ніколи не піпетуйте ротом.
• Позначте зразок та відповідну пробірку, щоб забезпечити точне призначення.
• Для кожного зразка використовуйте нову пробірку.
• Під час етапів інкубації та промивання лунки мають бути повністю покриті рідиною.
• Щоб уникнути перехресного зараження та хибно завищених результатів тесту, піпеткою внесіть зразки пацієнта та кон’югат у лунки ІФА планшета.
• MegaELISA® EHRLICHIA canis надається лише для використання кваліфікованим персоналом, який знає техніку роботи ІФА.

Необхідно суворо дотримуватися процедури випробування, інформації, заходів безпеки та попереджень, наведених у інструкції. Для використання тест-набору з діагностичним устаткування, метод тестування має бути валідований. Будь-яка зміна зовнішнього вигляду, складу та застосування, а також використання в поєднанні з іншими продуктами, не дозволеними виробником, заборонені. Виробник не несе відповідальності за помилкові результати та пов’язані з цим випадки. Відповідальність за такі зміни несе сам користувач. Не несеться відповідальність за неправдиві результати тесту через невірну візуальну оцінку.