MegaELISA® FeLV Antigen — це імуноферментна тест система для якісного виявлення вірусу котячої лейкемії (англ. FeLV) у плазмі або сироватці крові котів.

Вірус котячого лейкозу «ВКЛ» (анг. FeLV) — це висококонтагіозний онкогенний РНК-вірус, який викликає як неопластичні, так і непухлинні захворювання у котів у всьому світі.

Інфікування вірусами котячого лейкозу передається переважно через: виділення (наприклад, слина), виділення (наприклад, кал, сеча), а також внутрішньоутробно при переливанні крові та через молозиво. Оскільки віруси котячого лейкозу залишаються активними у навколишньому середовищі лише лічені хвилини, успішне зараження може відбутися лише під час близького контакту з інфікованими котами.

Перебіг інфекції значною мірою залежить від імунного статусу, віку, а також від дози та вірулентності вірусу. Захворювання, спричинені вірусом котячого лейкозу, включають: лімфосаркому, мієлолейкоз, атрофію тимуса, нерегенеративну анемію та захворювання, подібне до панлейкопенії.

Оскільки «ВКЛ» – імуносупресив, це провокує до інфікування різноманітних вторинних захворюваннями. Кішки, інфіковані вірус котячого лейкозу, зазвичай демонструють високі концентрації позаклітинного (вільного) антигену p27 через 3 тижні після інфікування. Виявлення антигену p27 є надійною методикою діагностики вірусу.

MegaELISA® FeLV Antigen тест система використовує високоспецифічні моноклональні антитіла проти антигену p27, є важливим діагностичним інструментом для оцінки клінічно підозрілих кішок (відокремлення котів-носіїв FeLV) та для перевірки перед вакцинацією.

На роботу MegaELISA® FeLV Antigen — це імуноферментна тест система для якісного виявлення вірусу котячої лейкемії (англ. FeLV) у плазмі або сироватці крові котів. тест системи ані материнські антитіла, ані «ВКЛ» вакцинація не впливають.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® FeLV Antigen — це якісний «сендвіч» імунологічний аналіз для виявлення антигену вірусу котячої лейкемії (FeLV).

Моноклональні антитіла проти антигену р27 зв’язуються з поверхнею лунки ІФА планшета. Котяча плазма або сироватка, а також контролі інкубуються на першому етапі при кімнатній температурі (20–25 °C) в лунках ІФА планшета. Після етапу промивання додають анти-p27 кон’югат, мічений пероксидазою хрону (HRP), та інкубують при кімнатній температурі (20–25 °C). Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидину [TMB]) у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює колір з безбарвного на блакитний у лунках ІФА планшета. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Згасання жовтого розчину в ІФА планшеті пропорційне концентрації присутніх у зразку антигенів вірусу котячого лейкозу.

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

КОМПОНЕНТИ / РЕАГЕНТИ, що постачаються разом з тест-набором

Реактивів однієї упаковки вистачає на 48 або 96 визначень.

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте лише зразки плазми чи сироватки котів.
• Перед використанням добре перемішайте матеріал зразка.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів. Зразки плазми або сироватки можна брати на аліквоти та постійно зберігати при мінімум –20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• Деякі ліпемічні або гемолітичні зразки можуть викликати колір фону. У таких випадках рекомендується повторити тест із зразками кращої якості.
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування. Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

 Змішайте 1 частину (50 мл) концентрату промивного буфера з 9 частинами (450 мл) дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати його при кімнатній температурі (15–25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКІВ ТА КОНТРОЛЯ

• Зразки наносяться нерозведеними.
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції зразки не повинні містити часток, відцентрифугуйте зразки на 5000 об/хв протягом 5 хвилин щоб уникнути цього.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

• Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.
• Перед початком розташування зразків пацієнта та стандартів/контролів у планшеті для мікротитрування необхідно визначити на аркуші для результатів, що постачається разом із набором. Рекомендується принаймні дублювати.
• Використовуйте чисті наконечники піпеток для кожного етапу дозування.

ВІДБІР ПРОБ ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

• Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.
• Додати:

– 50 мкл позитивного контролю (2×)

– 50 мкл негативного контролю (2×)

– 50 мкл нерозведеного зразка (2×)

кожен у потрібному порядку в певну порожнину стрип-смужки.

Залиште одну лунку порожньою для субстрату.

• Обережно струсіть ІФА планшет, накрийте його та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 4 рази 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю злийте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: Зразки, які все ще містять будь-які частинки, слід вручну видалити з порожнин, струсивши (небезпека закупорки промивних голок).
• Стежте за правильним налаштуванням промивної станції.
• Для досягнення оптимальних результатів промивання використовуйте принаймні 300 мкл промивного буфера на одну лунку та на етап промивання.
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл кон’югату в кожну порожнину стрип-смужки.
• Обережно струсіть ІФА планшет, накрийте його та інкубуйте протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.
• Вимийте, як описано раніше.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату (TMB) у кожну порожнину стрип-смужки, за винятком лунки для субстрату.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 5 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C і в темряві).

ЗУПИНКА РЕАКЦІЇ

 Додайте 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку стрип-смужки.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується додаткове вимірювання на референційній довжині хвилі 620 нм.
• Налаштуйте пристрій для зчитування ІФА планшетів на нуль за допомогою бланка субстрату. Якщо через технічні причини ІФА зчитувач не можна налаштувати на нуль за допомогою лунки для субстрату, щоб отримати надійні результати, відніміть значення екстинкції цієї лунки від усіх інших значень вимірювання.
• Якщо було зроблено дублікати або багаторазові визначення, обчисліть середнє значення поглинання.

ОЦІНЮВАННЯ ТЕСТУВАННЯ

СТАБІЛЬНІСТЬ РЕАГЕНТУ – ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні контрольні значення:

• Позитивний контроль 1,0 < Екстинкція < 2,0
• Негативний контролю Екстинкція < 0,1

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

Значення Оптичної Щільності (ОЩ) «англ. OD» зразків розраховуються по відношенню до позитивного контролю (ПК), що відповідає 100 %.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

Позитивний результат тесту

Процентне значення зразка перевищує 11 %.

Граничний результат тесту

Процентне значення зразка становить 5,6–11 %. Якщо повторний тест через 2–4 тижні з новим зразком також є граничним, тоді зразок слід оцінити як негативний.

 Результат тесту негативний

Процентне значення зразка нижче 5,6 %.

ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

Інтерпретація результату тесту завжди повинна базуватися на анамнестичних та клінічних даних, а також на терапії та профілактиці.

MegaELISA® FeLV Antigen = НЕГАТИВНИЙ → віремії немає

– неінфікований кіт (приблизно 95 %)

– латентно інфікований кіт (антиген не виявляється)

– тестування в перші 4 тижні після інфікування

MegaELISA® FeLV Antigen = перший раз ПОЗИТИВНИЙ →  підозра на вірусемію – тимчасово або стійко інфікований кіт

ПОРАДА: повторити тест через 4–8 тижнів. Рекомендується ізоляція кота протягом цього часу (ВКЛ линька!).

MegaELISA® FeLV Antigen = другий раз ПОЗИТИВНИЙ →  віремія

→  розрізняють транзиторну або стійку вірусемію

→  3-й тест через 6 тижнів

→  4-й тест ще через 10 тижнів

•  кіт все ще позитивний → підозра на стійку вірусемію

→  «кіт-прогресор» із високим ризиком розвитку захворювань, пов’язаних з «ВКЛ».

• кіт стає негативним → підозра на транзиторну вірусемію

→ «кіт-регресор» (повна елімінація вірусу, здоровий)

→ латентна інфекція (інтегрований провірус в кістковий мозок)

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• Бактеріальне забруднення або повторювані цикли заморожування-розморожування зразка можуть вплинути на значення екстинкції.
• Діагноз інфекційного захворювання не можна встановлювати на підставі одного результату дослідження. Точний діагноз повинен брати до уваги клінічний анамнез, симптоматику, а також серологічні дані.