MegaELISA® FCoV – імуноферментний аналіз для якісного виявлення антитіл IgG проти коронавірусу (FCoV) у плазмі, сироватці крові або випоті кота.

Інфекційний перитоніт котів  (ІПК) – поширена у всьому світі хронічна прогресуюча вірусна інфекція, часто з летальним результатом. Згідно з останніми дослідженнями, ІПК не є інфекцією, що передається від кішки до кішки. ІПК виникає спорадично у домашніх та диких котячих, інфікованих ороназально апатогенним коронавірусом котів (FCoV). Внаслідок стресу патогенний FCoV мутує у патогенний вірус ІПК. Поширеність антитіл до коронавіруса варіює залежно від способу утримання: у розплідниках з декількома котячими сім’ями від 50 до 80 %, у приватних домогосподарствах домогосподарствах – лише 15 %.

Залежно від прогресування та прояву в органах коронавірус котів змінюється клінічно. Зазвичай існує плавний перехід між формами ІПК, тому ІПК може бути більш «мокрим» або більш «ефузивним».

Тому всіх котів з незрозумілими симптомами, такими як рецидивуюча лихоманка, стійка до антибіотикотерапії, незрозумілі зміни в органах, хронічна втрата ваги, плевральний та/або перитонеальний випіт, слід вважати підозрілими на інфекційний перитоніт.

Через те, що фактично не існує методу тестування, який може диференціювати інфекційний перитоніт котів та коронавірус котів, виявлення антитіл до коронавірусу котів є дуже важливим діагностичним інструментом. Здорові коти з негативним результатом тесту на антитіла, швидше за все, не є ні носіями, ні екскреторами. MegaELISA® FCoV тест система використовує високоспецифічні рекомбінантні антигени коронавірусу котів, є оптимальним скринінговим тестом для надійного виявлення антитіл проти у плазмі, сироватці або випоті кота.

MegaELISA® FCoV – якісний імуноферментний аналіз для виявлення антитіл IgG проти коронавірусу котів за принципом «сендвіча». Специфічні, рекомбінантні антигени зв’язуються з поверхнею лунки в ІФА планшеті. Розведені зразки вносять піпеткою в лунки планшета та інкубуються при кімнатній температурі (20-25 °C). Антитіла, присутні в зразку, зв’язуються з антигенами та виявляються на другому етапі за допомогою ферментно міченого кон’югату.

Незв’язаний кон’югат видаляється на наступному етапі промивання. Фермент змінює колір субстрату (тетраметилбензидин [ТМБ]) з безбарвного на синій.

Додаванням стоп-розчину ферментативна реакція зупиняється, колір змінюється з синього на жовтий. Екстинкція вимірюється при 450 нм та є пропорційною концентрації специфічних антитіл IgG проти коронавірусу котів, присутніх у зразку.

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Тест підходить для виявлення антитіл проти коронавірусу в плазмі, сироватці або лікворі кота.
• Перед використанням добре перемішайте зразок.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів.
• Плазма або сироватка, розведені 1:600 у буфері відповідно до «Підготовка зразків», можна зберігати для тестування: суміші зразків та буфера (SBM) стабільні до 28 днів при кімнатній температурі, при 2–8 °C вони стабільні до 2 місяців, при –20 °C їх можна зберігати постійно та розморожувати / заморожувати до 10 разів.
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування. Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину концентрату промивного буфера з 9 частинами дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати його при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:101 чи 1:100

 Зразки для тестування розводять 1:101 або 1+100 буфером для розведення зразків (SDB), наприклад, 5 мкл зразка + 500 мкл SDB.

• Добре гомогенізуйте зразок та буферну суміш (SBM) (повторіть змішування піпеткою або на «вортекс»)
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції, SBM має бути вільним від частинок! Щоб гарантувати це, відцентрифугуйте SBM при 5000 об/хв протягом 5 хвилин.

• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

• Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.
• Перед початком роботи необхідно визначити положення зразків пацієнта і стандартів/контролів у мікротитрованому планшеті на «Оціночний лист», що додається до набору. Рекомендується тестувати контролі та зразки в двох екземплярах.
• При кожному піпетуванні використовуйте чисті одноразові наконечники для піпеток.

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

 Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.

Додати 50 мкл:

• позитивного контролю
• негативного контролю
• розведеного у SBM зразка

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

Залиште одну лунку порожньою для бланк субстрату.

• Накрийте планшет та інкубуйте 60 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 4 разів 300 мкл промивного буфера на кожну лунку. Злегка струсіть планшет із промивним буфером, потім видаліть його
• Повністю видаляйте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.
• Перед останнім постукуванням подбайте про підготовку реагенту для наступного етапу піпетування.

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції!
• Для досягнення оптимальних результатів промивання використовуйте принаймні 300 мкл промивного буфера на одну лунку.
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл кон’югату в кожну лунку стрип-смужки, окрім лунки для Бланк Субстрату.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

  Промийте, як вказано в пункті 8.2.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату (TMБ) у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.
• Додайте 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку стрип-смужки в такому ж порядку та з такою ж швидкістю, як для розчину субстрату ТМБ.

ВИМІРЮВАННЯ

Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується додаткове вимірювання на референційній довжині хвилі 620 нм.

• Налаштуйте пристрій для зчитування ІФА планшетів на нуль за допомогою бланка субстрату. Якщо через технічні причини ІФА зчитувач не можна налаштувати на нуль за допомогою лунки для субстрату, щоб отримати надійні результати, відніміть значення екстинкції цієї лунки від усіх інших значень вимірювання.
• Якщо було зроблено дублікати або багаторазові визначення, обчисліть середнє значення поглинання.

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити чорнуваті осади розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад 1:1. Потім розведіть зразок 1:100 буфером для розведення зразка та помножте результати в «Мегакор Одиниця»* на 2.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні контрольні значення:

• Позитивний контроль: Екстинкція > 1.5
• Негативний контролю: Екстинкція < 0.2
• Субстрат:                           Екстинкція < 0.1

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами.

РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

 Значення відсікання становить 0.700

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

Позитивний результат тесту

Зразок з екстинкцією більше ніж на 10 % вище за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10 % вище і нижче значення відсікання. Повторний тест через 2-4 тижні з новим зразком, який також є маргінальним, слід оцінювати як негативним!

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

Результати в одиницях MEGACOR (MU)

Значення відсікання	10 MU
Негативний результат:	< 9 MU
Сіра зона:	9-11 MU
Позитивний результат:	> 11 MU