MegaELISA® ANAPLASMA phagocytophilum – імуноферментний аналіз для якісного виявлення антитіл IgG проти Anaplasma phagocytophilum у плазмі або сироватці крові собаки.

Анаплазмоз – інфекційне захворювання, що передається бактеріями, яке може викликати різні клінічні симптоми залежно від переносника або виду збудника. Збудник Anaplasma phagocytophilum переважно зустрічається у північній півкулі, викликаючи гранулоцитотропний анаплазмоз. Відіграє важливу епідеміологічну роль у собак. Інші ссавці, а також люди (зооноз) також можуть бути заражені від укусу кліща.

В Європі приблизно 2–4,5% кліщів (особливо видів Ixodes ; Dermacentor spp.) інфіковані – A. phagocytophilum. Дослідження в Німеччині свідчать, що серопоширеність собак становить від 19 до 50%. Захворюваність на одноразову інфекцію A. phagocytophilum низька, але ко-інфекції (наприклад, Borrelia burgdorferi, E. canis) збільшить клінічний перебіг.

З часом передачі, зазвичай, до 25 годин після укусу кліща та інкубаційним часом 2–20 днів, інфекції, як правило, мають субклінічний характер або самоминучі. Титри антитіл зазвичай збільшуються через 2–3 тижні після зараження, залишаються протягом кількох місяців та знижуються до нормального рівня через 7 місяців. Клінічними симптомами є лихоманка, апатія, ригідність м’язів, поліартрит із болем/набряканням суглобів, кульгавість, втрата ваги, тромбоцитопенія, анемія, петехіальні кровотечі та підвищення рівня запалення (СРБ, гаптоглобін). Субарахноїдальний крововилив може призвести до розладів центральної нервової системи. Смертність – низька.

Застосовуючи MegaELISA® ANAPLASMA phagocytophilum ветеринар може визначити статус антитіл до A. phagocytophilum у підозрілої тварини. Це дає можливість розпочати подальші профілактичні та лікувальні заходи.

MegaELISA® ANAPLASMA phagocytophilum детекція інфекції на високоспецифічних рекомбінантних пептидах для швидкого та надійного виявлення антитіл проти Anaplasma phagocytophilum у плазмі або сироватці собаки.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® ANAPLASMA phagocytophilum – це якісний «сендвіч» імунологічний аналіз для виявлення антитіл IgG проти Anaplasma phagocytophilum.

Специфічні рекомбінантні антигени Anaplasma phagocytophilum зв’язуються з поверхнею лунки ІФА планшета.

Для тестування розведення плазми або сироватки собаки, а також контролі інкубують на першому етапі при кімнатній температурі (20–25 °C) в лунках ІФА планшета. Після етапу промивання, додається кон’югат IgG, мічений пероксидазою хрону (HRP) та інкубують  при кімнатній температурі (20-25°C). Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидину [TMB]) у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює колір з безбарвного на блакитний у лунках ІФА планшета. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Згасання пропорційне концентрації антитіл IgG, специфічних до Anaplasma, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте лише зразки плазми чи сироватки собак.
• Перед використанням добре перемішайте матеріал зразка.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів. Зразки плазми або сироватки можна брати на аліквоти та постійно зберігати при мінімум –20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• Деякі ліпемічні або гемолітичні зразки можуть викликати колір фону. У таких випадках рекомендується повторити тест із зразками кращої якості.
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину (50 мл) концентрату промивного буфера з 9 частинами (450 мл) дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати його при кімнатній температурі (15–25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:101

• Зразки для тестування розводять 1:101 буфером для розведення зразків (SDB, наприклад, 5 мкл зразка + 500 мкл SDB).
• Добре гомогенізуйте зразок та буферну суміш (SBM) (повторіть змішування піпеткою або на «вортекс»)
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції, SBM має бути вільним від частинок! Щоб гарантувати це, відцентрифугуйте SBM при 5000 об/хв протягом 5 хвилин.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

• Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.
• Перед початком розташування зразків пацієнта та стандартів/контролів у планшеті для мікротитрування необхідно визначити на аркуші для результатів, що постачається разом із набором. Рекомендується принаймні дублювати.

ВІДБІР ПРОБ ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

• Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.
• Додати 50 мкл

– позитивного контролю

– негативного контролю

– нерозведеного у SBM зразка

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

Залиште одну лунку порожньою для субстрату.

• Обережно струсіть ІФА планшет, накрийте його та інкубуйте 60±5 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 5 рази 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю злийте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

 

ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• Перевірте налаштування промивної станції (5 × 350 мкл)!
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунки, струсивши (небезпека закупорки промивних голок).

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл кон’югату в кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

Промийте, як вказано в пункті 8.2.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату (TMB) у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 15 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C і в темряві).
• Додайте 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку стрип-смужки в такому ж порядку та з такою ж швидкістю, як для розчину субстрату ТМВ.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується додаткове вимірювання на референційній довжині хвилі 620 нм.
• Налаштуйте пристрій для зчитування ІФА планшетів на нуль за допомогою бланка субстрату. Якщо через технічні причини ІФА зчитувач не можна налаштувати на нуль за допомогою лунки для субстрату, щоб отримати надійні результати, відніміть значення екстинкції цієї лунки від усіх інших значень вимірювання.
• Якщо було зроблено дублікати або багаторазові визначення, обчисліть середнє значення поглинання.

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити чорнуваті осади розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад 1+1. Потім розведіть зразок 1:101 буфером для розведення зразка та помножте результати в «Мегакор Одиниця»* на 2.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

СТАБІЛЬНІСТЬ РЕАГЕНТУ – ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні контрольні значення:

• Позитивний контроль 0,8 < Екстинкція < 2,0
• Негативний контролю Екстинкція < 0,1
• Субстрат Екстинкція < 0,1

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

 Значення відсікання: 0,190

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

Позитивний результат тесту

Процентне значення зразка перевищує 10 % але менше за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10% вище і нижче значення відсікання. Якщо повторний тест через 2–4 тижні з новим зразком також є граничним, тоді зразок слід оцінити як негативний.

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

Значення відсікання: 10 «МО»

Сіра зона: 9-11 «МО»

Негатив: < 9 «МО»

Позитив: > 11 «МО»

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

•  Бактеріальне забруднення або повторювані цикли заморожування-розморожування зразка можуть вплинути на значення екстинкції.
• Діагноз інфекційного захворювання не можна встановлювати на підставі одного результату дослідження. Точний діагноз повинен брати до уваги клінічний анамнез, симптоматику, а також серологічні дані.