MegaELISA® DIRO Antigen – імуноферментний аналіз для якісного виявлення антигенів Dirofilaria immitis у плазмі або сироватці собаки.

Дірофіляріоз собаки, кішки, тхора, а також інших м’ясоїдних тварин викликає так званий «серцевик», нематода сімейства філярій під назвою Dirofilaria immitis. Можливе зараження людини (тупиковий хазяїн) (зооноз). Філярії паразитують в легенях та сполучній тканині, але діагностуються рідко.

Інфікування:

Передача відбувається через інфіковані види комарів-гематофагів (Culicidae), які вивільняють інфекційні личинки D. immitis (стадія L3) у кров хазяїна з укусом. Після розвитку личинки (стадія L4) в гіподермі хазяїна (приблизно через 8 днів після зараження) вони мігрують у кровообіг. Розвиток дорослих глистів (макрофілярій: товщиною до 1 мм, довжиною 20–30 см) відбувається не раніше 80 днів після інфікування. Найбільша кількість в легеневій артерії та в правій камері серця. Доросла самка паразита двостатевих макрофілярій виробляє нові личинки (стадія L1, мікрофілярія) через 6 місяців. Вони виділяються разом з антигенами жіночого репродуктивного тракту в периферичну кров (мікрофіларемія) і знову поглинаються комарами при смоктанні. У комарів личинка 1 розвивається у заразну личинку 3.

Ступінь захворювання залежить від кількості дорослих глистів («глистоподібний вантаж», як правило, більше 30), локалізації, тривалості інфекції та імунологічної реакції господаря.

Симптоматика:

По-перше, дирофіляріоз – серцево-легенева хвороба, яка протікає безсимптомно. На пізній стадії виникає правобічна серцева недостатність та легеневе тіло. Симптоми: кашель, задишка, шуми в серці та легенях, набряки, а також швидка стомлюваність. У маленьких собак при великому «глистовому вантажі» виникає «синдром порожнистої вени». Тобто обтураційний стеноз через масивне скупчення паразитів у задній порожнистій вені та правому передсерді. Це призводить до внутрішньосудинного гемолізу, шоку, ниркової недостатності та раптовій смерті.

Через досить складну клінічну діагностику та короткочасну мікрофіларемію, рекомендується повторне тестування системою MegaELISA® DIRO Antigen.

MegaELISA® DIRO Antigen – щвидкий та надійний метод діагностики, виявляє групово-специфічні антигени активного репродуктивного тракту дорослої самки D. immitis. Через тривалий час інкубації після інфікування (після перебування у дірофіляріозних регіонах) тестування за допомогою MegaELISA® DIRO Antigen слід проводити не раніше, ніж через 6 місяців після перебування в регіонах з дирофіляріозом.

MegaELISA® DIRO Antigen— це якісний імунологічний аналіз для виявлення антигенів Dirofilaria immitis за принципом “сендвіча” у плазмі або сироватці інфікованих собак.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® DIRO Antigen— це якісний імунологічний аналіз для виявлення антигенів Dirofilaria immitis за принципом “сендвіча” у плазмі або сироватці інфікованих собак.

Специфічні моноклональні антитіла проти циркулюючих антигенів Dirofiaria immitis зв’язуються з поверхнею лунок у ІФА планшеті. Плазму або сироватку крові собаки, що підлягає дослідженню, а також контрольні зразки інкубують на першому етапі при кімнатній температурі (20–25 °C) в лунках ІФА планшета разом із кон’югатом IgG міченим пероксидазою хрону. Незв’язаний кон’югат видаляють на етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидину [TMB]) у позитивних зразках зв’язаний фермент перетворює безбарвний розчин у лунках планшета на блакитний розчин, який можна оцінити візуально.

 

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте лише зразки плазми чи сироватки котів.
• Перед використанням добре перемішайте матеріал зразка.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів. Зразки плазми або сироватки можна брати на аліквоти та постійно зберігати при мінімум –20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• Деякі ліпемічні або гемолітичні зразки можуть викликати колір фону. У таких випадках рекомендується повторити тест із зразками кращої якості.
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.
• При підозрі на «хибно негативний» та клінічні симптоми дирофіляріозу (див.: Інтерпретація результатів тесту) рекомендується теплова обробка плазми / сироватки перед тестуванням для підвищення чутливості визначення антигену.
• Нагрійте плазму/сироватку в блочному термостаті до 103 °C протягом 10 хвилин. Негайно центрифугуйте отриманий коагулят протягом 5 хвилин при 16 000 × g, (альтернативно: 8–12 000 × g). Отриманий супернатант може бути використаний як матеріал зразка для процедури випробування.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування. Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

 ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину (60 мл) концентрату промивного буфера з 9 частинами (540 мл) дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом року, якщо зберігати його при кімнатній температурі (2 – 8 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКІВ ТА КОНТРОЛЯ

• Зразки наносяться нерозведеними.
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції зразки не повинні містити часток, відцентрифугуйте зразки на 5000 об/хв протягом 5 хвилин щоб уникнути цього.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

 ПРОЦЕДУРА ВИПРОБУВАННЯ

• Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.
• Перед початком розташування зразків пацієнта та стандартів/контролів у планшеті для мікротитрування необхідно визначити на аркуші для результатів, що постачається разом із набором. Рекомендується принаймні дублювати.
• Використовуйте чисті наконечники піпеток для кожного етапу дозування.

ВІДБІР ПРОБ ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

• Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.
• Додати

– 1 крапля позитивного контролю (2×)

– 1 крапля негативного контролю (2×)

– 30 мкл зразка (2×)

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

• Додайте 2 краплі кон’югату в кожну лунку тест-смужки
• Накрийте планшет та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–20 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 5 рази 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю злийте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: Зразки, які все ще містять будь-які частинки, слід вручну видалити з порожнин, струсивши (небезпека закупорки промивних голок).
• Стежте за правильним налаштуванням промивної станції.
• Для досягнення оптимальних результатів промивання використовуйте принаймні 300 мкл промивного буфера на одну лунку та на етап промивання.
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 2 краплі кон’югату в кожну порожнину стрип-смужки.
• Накрийте планшет та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–20 °C) у темряві.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (м’яко перемішуйте від краю) колір окремих лунок можна спостерігати візуально.

СТАБІЛЬНІСТЬ РЕАГЕНТУ – ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні значення:

• Позитивний контроль Синій колір
• Негативний контролю Немає кольору

Варіації значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

 ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

• Оцінка зразків повина бути проведена через 10 хвилин (не більше 15 хв.).
• Тримайте стрипи/планшет над білою поверхнею, це спростить зчитування результатів

Позитивний результат тесту

Видно синій колір. Інтенсивність кольору може змінюватись та залежить від кількості антигену в зразку.

Негативний результат тесту

Колір зразка не змінюється.

ОЦІНЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

• Інтерпретація результату тесту завжди повинна базуватися на анамнестичних та клінічних даних, а також на терапії та профілактиці.

Причини хибно позитивних результатів тесту

• Собака з мертвою дорослою дирофілярією залишається антигенпозитивною протягом прибл. 3–4 місяці → рекомендовано провести другий тест через 4 місяці!

Причини хибно негативних результатів тесту

• Собака з періодом інфекції менше 6 місяців
• Дуже «низьке навантаження» гельмінтами
• Зараження тільки самцями Dirofilaria, зараження не вагітною самкою Dirofilaria (інфекція однієї статі)
• Маскування антигену імунними комплексами (тривалий прийом препаратів з макроциклічними лактонами («ліки повільно вбивають»), запалення). Рекомендація: теплова інактивація плазми / сироватки (читайте: «Інформація про матеріал зразка»).

ЗАХОДИ БЕЗПЕКИ ТА ЗАСТЕРЕЖЕННЯ

• Одягніть захисний одяг (одноразові рукавички) та вимийте руки після завершення процедури тестування.
• Не можна їсти і пити під час тестування.
• Зразок матеріалу та контролі слід розглядати як потенційно інфекційні та утилізувати відповідно разом із використаними компонентами тест-набору.
• Не використовуйте реагенти інших виробників разом з реагентами цього тест-набору.
• Не змішуйте реагенти з різними номерами партій.
• Не міняйте ковпачки окремих реагентів між собою.
• Закрийте флакони одразу після використання, щоб уникнути випаровування та мікробного забруднення.
• Після першого відкриття флакони з реагентами необхідно перевірити на наявність мікробного забруднення перед повторним використанням.
• Розчин субстрату містить перекис водню. Уникайте контакту з очима, шкірою.
• УВАГА: Рідкі відходи, що містять стоп-розчин, необхідно нейтралізувати перед додаванням їх у розчин гіпохлориту!
• Використовуйте лише чисті наконечники піпеток, дозатор і лабораторний матеріал.
• Ніколи не піпетуйте ротом.
• Позначте зразок та відповідну пробірку, щоб забезпечити точне призначення.
• Для кожного зразка використовуйте нову пробірку.
• Під час етапів інкубації та промивання лунки мають бути повністю покриті рідиною.
• Щоб уникнути перехресного зараження та хибно завищених результатів тесту, піпеткою внесіть зразки пацієнта та кон’югат у лунки ІФА планшета.
• MegaELISA® DIRO Antigen надається лише для використання кваліфікованим персоналом, який знає техніку роботи ІФА.

 

Необхідно суворо дотримуватися процедури випробування, інформації, заходів безпеки та попереджень, наведених у інструкції. Для використання тест-набору з діагностичним устаткування, метод тестування має бути валідований. Будь-яка зміна зовнішнього вигляду, складу та застосування, а також використання в поєднанні з іншими продуктами, не дозволеними виробником, заборонені. Виробник не несе відповідальності за помилкові результати та пов’язані з цим випадки. Відповідальність за такі зміни несе сам користувач. Не несеться відповідальність за неправдиві результати тесту через невірну візуальну оцінку.