SYBR Green Мікс  призначен для високоспецифічної ПЛР у реальному часі з інтеркалюючим барвником SYBR Green. Барвник SYBR Green зв’язується з дволанцюговою ДНК, забезпечуючи флуоресцентний сигнал, який відображає кількість продуктів отриманих у ході ПЛР. Мікс містить усі необхідні для ПЛР компоненти, крім праймерів та матричної ДНК. Реакційний буфер оптимізован для специфічної роботи Хот Старт Taq – полімерази, а також для тривалого зберігання та багаторазового заморожування-розморожування суміші.

Мікс розроблений для проведення ПЛР та детекції на обладнанні:

BioRad iCycler MiniOpticon, Opticon 2, Chromo 4, iQ5; Roche LightCycler 480; MJ Research DNA Engine Opticon 2, Corbett Rotogene 3000, 6000.

Застосування:

• Аналізу експресії генів;
• Перевірки мікрочіпів;
• Перевірка «нокдауну» гена

Склад міксу:

100 мМ KCl,
5 мМ MgCl₂,
400 мкл дНТФ,
0,1 од./мкл Taq ДНК-полімерази,
1x SYBR Green I
та інші оптимізовані компоненти буфера.

 

Основний ПЛР протокол:

Цей протокол призначений для використання з: BioRad iCycler MiniOpticon, Opticon 2, Chromo 4, iQ5; Roche LightCycler 480; MJ Research DNA Engine Opticon 2, Chromo 4; Corbett Rotor Gene 3000, 6000.

Мікс не сумісний з обладнанням, для якого потрібен референсний барвник ROX.

1. Приготуйте реакційну суміш у стерильній пробірці. Всі операції необхідно проводити на льоду.

Примітка:

• Концентрація праймера може бути додатково оптимізована. Оптимальний діапазон для праймерів становить 0,1-1 мМ.
• Підготуйте реакційну суміш відповідно до рекомендацій виробника обладнання.
• Використовуйте 1-10 нг кДНК або 10-100 нг геномної ДНК для проведення реакції.
• Дозволяється зменшити кількість міксу кПЛР, якщо крива плавлення має нечіткі піки.

2. Перенесіть реакційну суміш у пробірки/планшет для ПЛР. Реакційні об’єми можуть бути зменшені до 10 мкл, якщо прилад підтримує систему з малим об’ємом. Закрийте пробірки / планшет, центрифугуйте.

3. Постановка кПЛР:

Стандартний 3-х етапний режим ПЛР:

 

* достатньо 20 сек. при 95 ° С для активації ферменту, однак оптимальна денатурація комплексу може бути до 3 хв.

Примітка:

SYBR Green Мікс  пригнічує активність Taq-полімерази при температурі нижче 60°C, стандартна 3-х етапна ПЛР має кращу стабільність та повторюваністю, ніж 2-х етапна ПЛР.

4. Проаналізуйте отримані результати. Аналіз даних варіюється в залежності від використовуваного обладнання. Будь ласка, зверніться до керівництва користувача Вашого обладнання.

Матриці

У якості матриці можуть бути використані: геномна ДНК, плазмідна ДНК або кДНК. Для отримання оптимальних кількісних результатів, використовуйте до 20 нг геномної або плазмідної ДНК на 20 мкл реакції (для менших об’ємів, кількість матриці має бути еквівалентно зменшена). Використання більшої кількості матриці може зменшити сигнал флуоресценції та лінійність стандартних кривих, завдяки зв’язуванню SYBR ® Green I з матрицею.

Для двоетапної ОТ-ПЛР використовуйте нерозведену кДНК. Об’єм доданої кДНК не повинен перевищувати 10% від кінцевого об’єму (наприклад, 20 мкл реакції кПЦР – до 2,0 мкл нерозведеної кДНК).

Праймери

Рекомендовано використовувати праймери, очищені методом (ВЕРХ). Таким чином мінімізуючи втрату чутливості. 

Щоб максимізувати чутливість, використовуйте найнижчу концентрацію праймерів (50-400 нМ кожного праймера). Для досягнення оптимальних результатів використовуйте праймери, які ампліфікують продукти ПЛР довжиною 60-400 п.н. Праймери повинні мати температуру плавлення (t_п) приблизно 60°С.