Набір для екстракції ДНК та РНК з навколишнього середовища
Склад набору:
Опис:
Набір для екстракції ДНК та РНК з навколишнього середовища використовує методи подрібнення кульок та очищення на силікагелевій колонці для швидкого й безпечного виділення РНК та ДНК із зразків ґрунту, фекалій, проб навколишнього середовища та водних зразків водночас. Весь процес екстракції займає всього 50 хвилин. Набір для екстракції ДНК та РНК з навколишнього середовища використовується для одночасного виділення РНК та ДНК із зразків ґрунту ≤500 мг, фекалій ≤200 мг, фільтрів водойм, осаду або ферментативної суспензії. Отримана РНК може бути безпосередньо використана у РТ-ПЛР, Northern Blot. Отримана ДНК може бути безпосередньо використана у ПЛР, Southern Blot тощо.
Зберігання:
Набір зберігати при кімнатній температурі (15 – 25 ̊C) протягом 18 місяців.
Підготовка:
– Безводний етанол (96-100%)
– Додайте безводний етанол до буфера RW2 в об’ємі, що в чотири рази перевищує об’єм буфера, і зберігайте при кімнатній температурі.
Протокол:
- У пробірки на 2 мл додайте приблизно 0,5 г ґрунту, 0,1- 0,2 г фекалій, 0,3-0,5 г зразків з навколишнього середовища, 0,3 мл ферментативної суспензії, 0,3 мл мікробної суспензії та інші зразки.
- Додайте до зразка 600 мкл буфера STL та 100 мкл буфера PCI та щільно закрийте кришку.
Для сухих зразків з навколишнього середовища використовуйте сито, щоб видалити якомога більше сміття, наприклад, листя, каміння або дрібних гілочок, перед використанням. Для дуже сухих матеріалів, якщо матеріал зразка поглинає занадто багато буфера для лізису, візьміть зразок і відповідно збільште кількість буфера STL. Для дуже вологих матеріалів перед додаванням буфера лізису відцентрифугуйте, щоб видалити надлишок рідини. Контролюйте кількість зразка, щоб переконатися, що в пробірці достатньо місця для подрібнення шариків для лізису клітинних стінок. Як правило, зменшення кількості початкового матеріалу також може допомогти покращити ефективність лізису і підвищити чистоту РНК.
При використанні подрібнювача для кульок або вихрового змішувача з горизонтальним ротором рекомендується використовувати кріовіали з гвинтовою кришкою задля уникнення протікання рідини.
- Перенесіть суміш у вортекс та на максимальній швидкості протягом 10 хв. перемішуйте вміст або у подрібнювачі для кульок та 30 – 60 с подрібните зразок.
– Вихровий змішувач:
Рекомендується використовувати вихровий змішувач, обладнаний штативом для центрифужних пробірок об’ємом 2 мл. Час лізису повинен бути якомога коротшим, щоб мінімізувати вивільнення гумінових кислот. Залежно від зразка, збільшення часу лізису до 15 хвилин може бути корисним.
– Power Lyzer Bead Mill:
Рекомендується використовувати швидкість 2000 об/хв протягом 30 секунд, зробити паузу на 30 секунд, а потім знову продовжувати зі швидкістю 2000 об/хв ще 30 секунд.
–FastPrep24 Bead Mill:
Рекомендується використовувати швидкість 5 м/с протягом 30 секунд, зробити паузу на 30 секунд, а потім знову продовжувати зі швидкістю 5 м/с ще протягом 30 секунд.
– TissueLyser II Bead Mill:
Рекомендується проводити обробку при 25 Гц протягом 5 хвилин, перепозиціонувати зразки, провести обробку при 25 Гц ще протягом 5 хвилин.
Центрифугувати при 12 000 x g протягом 5 хвилин при кімнатній температурі.
- Перенесіть надосадову рідину (~550 мкл) у нову центрифужну пробірку, додайте 200 мкл буферу SL, перемішайте на вортексі протягом 5-10 секунд. Центрифугуйте при 12 000 x g протягом 5 хвилин.
- Перенесіть надосадову рідину в нову центрифужну пробірку, додайте 700 мкл зв’язуючого розчину GXP та інвертуйте 6-8 разів.
Адсорбція ДНК:
7. Помістіть ДНК-міні-колонку в 2 мл пробірку для збору зразків та перенесіть половину об’єму суміші в колонку. Центрифугуйте при 10 000 x g протягом 1 хвилини та перенесіть фільтрат у центрифужну пробірку об’ємом 5 мл.
8. Помістіть колонку з ДНК назад у пробірку для збору, перенесіть залишок суміші в колонку та центрифугуйте при 10 000 x g протягом 1 хвилини. Перенесіть фільтрат назад у 5 мл центрифужну пробірку, об’єднайте фільтрати з обох етапів та продовжуйте екстракцію РНК, як описано в кроці 16.
9. Помістіть ДНК колонку назад у пробірку для збору, додайте 500 мкл буфера GWP до колонки та центрифугуйте при 10 000 x g протягом 1 хвилини.
10. Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад у пробірку для збору та додайте 500 мкл буфера RW2 до колонки. Центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
11. Повторіть крок 10 ще раз.
12. Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад в пробірку для збору та центрифугуйте при 12 000 x g протягом 2 хвилин.
13. Помістіть колонку з ДНК в центрифужну пробірку на 1,5 мл. Додайте 30-50 мкл попередньо підігрітої безнуклеазної води при 65°C в центр мембрани колонки, дайте постояти при кімнатній температурі 5 хвилин, потім центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
14. Додайте ще 30-50 мкл попередньо підігрітої безнуклеазної води при 65°C в центр мембрани колонки. Дайте постояти при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, потім центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
15. Видаліть колонку з ДНК та зберігайте ДНК при температурі 2-8°C або -20°C.
Очищення РНК за допомогою міні спін-колонки:
- До фільтрату, отриманого на кроках 7-8, додають 0,5 об’єму безводного етанолу та перемішують 6-8 разів, ретельно перевертаючи до повного перемішування.
- Встановіть міні-колонку з РНК в пробірку для збору 2 мл. Перенесіть до 700 мкл суміші на колонку. Центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
- Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад у пробірку для збору. Перенесіть залишок суміші на колонку. Центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини. Повторюйте цей крок до тих пір, поки вся суміш не буде перенесена в колонку і центрифугована.
- Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад в пробірку для збору, додайте 500 мкл буфера RW1 в колонку і центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
- Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад у пробірку для збору і додайте 500 мкл буфера RW2 до колонки. Центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
- Повторіть крок 20 один раз.
- Видаліть фільтрат, помістіть колонку назад у пробірку для збору і центрифугуйте при 12 000 x g протягом 2 хвилин.
- Помістіть колонку з ДНК в 1,5 мл центрифужну пробірку. Додайте 30-100 мкл безнуклеазної води, в центр мембрани колонки, дайте постояти при кімнатній температурі 2 хвилини, потім центрифугуйте при 12 000 x g протягом 1 хвилини.
- Видаліть колонку і зберігайте РНК при -80ºC.
