Зворотна транскриптаза GМ – генетично модифікована зворотна транскриптаза (ревертаза). Перший ланцюг кДНК можна синтезувати при 37 – 55 ° С. Зворотна транскриптаза GМ значно покращила чутливість, специфічність, термічну стабільність.
Використовується для зворотної транскрипції РНК-матриць зі складною вторинною структурою. Зворотна транскриптаза GМ має більш сильну здатність до полімеризації, її можна використовувати для синтезу довгої кДНК та побудови повнорозмірної бібліотеки кДНК.
Визначення одиниці
Poly (rA) · Оліго (dT) використовували як матриця/праймер. При 37 °С протягом 10 хв. кількість ферменту, необхідна для додавання 1 нмоль dTTP у вигляді нерозчинної у кислоті речовини, визначається як 1 одиниця активності (U).
Вибір праймерів
Для максимального виходу повнорозмірної кДНК, якщо матриця має еукаріотичне походження, зазвичай переважним є Oligo dT у парі з 3 ‘Poly A хвостом еукаріотичної мРНК.
Генно -специфічні праймери (GSP) мають найвищу специфічність. Однак у деяких випадках GSP, що використовується для реакції ПЛР, не може ефективно керувати синтезом першого ланцюга кДНК. У цей момент зворотну транскрипцію можна повторити за допомогою Oligo dT або Випадковими гексамери.
Випадкові гексамери мають найнижчу специфічність, та всі РНК, включаючи мРНК, рРНК та тРНК, можуть бути використані як матриці для випадкових гексамерів.
Випадкові гексамери можна використовувати як праймер, якщо цільова область має складну вторинну структуру або високий вміст Г-Ц , або коли матриця є прокаріотичною, та використання Oligo dT або генно-специфічних праймерів (GSP) не може ефективно керувати синтезом кДНК.
Кількісна ПЛР (qPCR)
Oligo dT, змішаний з випадковими гексамерами, призвів до однакової ефективності синтезу кДНК у кожній області мРНК, допомагаючи покращити достовірність та повторюваність кількісних результатів.
Протокол
Синтез кДНК першого ланцюга
1. Приготували перший реакційний розчин синтезу кДНК
2. Провести реакцію синтезу кДНК першої нитки відповідно до наведених нижче умов
а. Цей крок потрібен лише при використанні випадкових гексамерів; Цей крок пропускається при використанні Oligo (dT) 23 VN або Gene Specific Primer.
b. Якщо шаблон має складну вторинну структуру або високу область Г-Ц, температуру реакції можна підвищити до 55 °С, що може допомогти збільшити вихід. Продукт можна негайно використати для ПЛР або зберігати при -20 °С та використовувати протягом пів року. Для тривалого зберігання рекомендується зберігати окремо при -70 ° C. Слід уникати повторного заморожування-розморожування кДНК.
ПЛР із зворотною транскрипцією (RT-PCR)
- Приготували реакційний розчин
Рекомендується взяти 1/10 ~ 1/5 продуктів зворотної транскрипції (2-4 мкл) як мартиці.
2. Провести реакцію RT-PCR відповідно до наведених нижче умов:
