MegaELISA® ENCEPHALITOZOON cuniculi – імуноферментний аналіз для якісного виявлення Encephalitozoon cuniculi у тварин.

Інфікування Encephalitozoon cuniculi відбувається спорами із сечі інфікованих тварин. Потрапляння, надзвичайно стійких, спор здебільшого відбувається через заражену їжу або потрапляє із  навколишнього середовища. Тому у домашніх та лабораторних тварин поширюється значно швидше, ніж серед диких тварин. М’ясоїдні тварини також можуть заразитися від інфікованої здобичі.

Неврологічні симптоми, ознаки ниркової недостатності, запалення шкіри та очей виникають внаслідок ураження центральної нервової системи, нирок та очей. Хворі кролі можуть мати один або кілька з цих симптомів. Найпоширенішим є, так званий, вестибулярний синдром (нахил голови, порушення координації рухів та тремтіння очей). Інші неврологічні симптоми можуть включати: судоми, неповний параліч та втрату рівноваги. У рідкісних випадках також спостерігається підвищена агресія та втрата слуху чи зору. У деяких тварин ниркова недостатність може бути із досить неспецифічними симптомами (втрата апетиту або маси тіла, зневоднення, порушення мінерального балансу, кісткового метаболізму, а також апатія).

Діагностика енцефалітозоонозу у кроликів in vivo є проблематичною через велику кількість тварин із хронічною, безсимптомною інфекцією. У цьому випадку антитіла можуть визначатися в крові роками. Серологічне виявлення антитіл проти E. cuniculi зазвичай є найбільш чутливим методом визначення інфекції; негативний титр антитіл протягом цього періоду зазвичай виключає інфекцію E. cuniculi.

MegaELISA® ENCEPHALITOZOON cuniculi детекція інфекції з використанням високоспецифічних антигенів для швидкого та надійного виявлення антитіл IgG проти Encephalitozoon cuniculi у плазмі або сироватці крові інфікованих кролів.

ВИКОРИСТАННЯ

MegaELISA® ENCEPHALITOZOON cuniculi — імуноферментний аналіз для якісного виявлення антитіл IgG проти Encephalitozoon cuniculi у плазмі або сироватці крові кролів.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® ENCEPHALITOZOON cuniculi – це якісний імунологічний аналіз для виявлення IgG проти Encephalitozoon cuniculi за принципом «сендвіча».

Специфічні антигени Encephalitozoon cuniculi зв’язуються з поверхнею лунки в ІФА планшеті. Розведені плазми або сироватки собаки, а також контролі інкубують на першому етапі при кімнатній температурі (20–25 °C) в лунках ІФА планшета. Після етапу промивання додають кон’югат IgG, мічений пероксидазою хрону, та інкубують при кімнатній температурі (20–25 °C). Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидину [TMБ]) у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює безбарвний розчин у лунках ІФА планшета на блакитний. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Згасання пропорційне концентрації антитіл IgG, специфічних до Encephalitozoon cuniculi, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте лише зразки плазми чи сироватки кролів.
• Перед використанням добре перемішайте матеріал зразка.
• Неохолоджену (20–25 °C) плазму або сироватку необхідно перевірити протягом 4 годин. При 2–8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 5 днів.
• Плазма або сироватка, розведені 1:600 у буфері відповідно до «Підготовка зразків», можна зберігати для тестування: суміші зразків та буфера (SBM) стабільні до 28 днів при кімнатній температурі, при 2–8 °C вони стабільні до 2 місяців, при –20 °C їх можна зберігати постійно та розморожувати / заморожувати до 10 разів.
• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також усі використовувані компоненти тест-набору повинні досягти кімнатної температури перед застосуванням.
• УВАГА: частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки ЕДТА, цитрату чи гепарину можуть створювати інтерференційні ефекти, що призведе до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину концентрату промивного буфера з 9 частинами дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер залишається стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати його при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:600

• Плазма та сироватка повинні бути розведені для тестування 1:600 за допомогою SDB, будь ласка, використовуйте принаймні 5 мкл зразка! Ми рекомендуємо працювати з попереднім розведенням.

Приклад:

• Попереднє розведення (1:10): 5 мкл зразка + 45 мкл SDB.
• Кінцеве розведення (1:600): 5 мкл попереднього розведення + 295 мкл SDB (= кінцева суміш зразка та буфера SBM)
• Добре гомогенізуйте зразок та буферну суміш (SBM) (повторіть змішування піпеткою або на «вортекс»)
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції, SBM має бути вільним від частинок! Щоб гарантувати це, відцентрифугуйте SBM при 5000 об/хв протягом 5 хвилин.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

 Добре перемішайте матеріал зразка перед застосуванням.

• Перед початком нанесення зразків та стандартів/контролів у планшет для мікротитрування необхідно зазначити на «Оціночний лист», що постачається разом із набором. Рекомендується дублювати.
• При кожному піпетуванні використовуйте чисті одноразові наконечники для піпеток.

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

 Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.

• Додати 50 мкл
• позитивного контролю
• негативного контролю
• розведеного у SBM зразка

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

Залиште одну лунку порожньою для бланк субстрату.

• Накрийте планшет та інкубуйте 60 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 5 разів 300 мкл промивного буфера на кожну лунку. Злегка струсіть планшет із промивним буфером, потім видаліть його
• Повністю видаляйте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.
• Перед останнім постукуванням подбайте про підготовку реагенту для наступного етапу піпетування.

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції!
• Для досягнення оптимальних результатів промивання використовуйте принаймні 300 мкл промивного буфера на одну лунку.
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл кон’югату в кожну лунку стрип-смужки, окрім лунки для Бланк Субстрату.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

  Промийте, як вказано в пункті “ПРОМИВАННЯ”

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату (TMБ) у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 15 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.
• Додайте 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку стрип-смужки в такому ж порядку та з такою ж швидкістю, як для розчину субстрату ТМБ.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується додаткове вимірювання на референційній довжині хвилі 620 нм.
• Налаштуйте пристрій для зчитування ІФА планшетів на нуль за допомогою бланка субстрату. Якщо через технічні причини ІФА зчитувач не можна налаштувати на нуль за допомогою лунки для субстрату, щоб отримати надійні результати, відніміть значення екстинкції цієї лунки від усіх інших значень вимірювання.
• Якщо було зроблено дублікати або багаторазові визначення, обчисліть середнє значення поглинання.

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити чорнуваті осади розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад 1:1. Потім розведіть зразок 1:600 буфером для розведення зразка та помножте результати в «Мегакор Одиниця»* на 2.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

СТАБІЛЬНІСТЬ РЕАГЕНТУ – ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Тест був правильним, коли були досягнуті наступні контрольні значення:

• Позитивний контроль 0,8 < Екстинкція < 2,2
• Негативний контролю Екстинкція < 0,1
• Субстрат Екстинкція < 0,1

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами.

РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУ

 Значення відсікання між знвченнями: 0,200 та 0,500

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

 Позитивний результат тесту

Процентне значення зразка перевищує 10 % але менше за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10% вище і нижче значення відсікання. Якщо повторний тест через 2–4 тижні з новим зразком також є граничним, тоді зразок слід оцінити як негативний.

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• Бактеріальне забруднення або повторювані цикли заморожування-розморожування зразка можуть вплинути на значення екстинкції.
• Діагноз інфекційного захворювання не можна встановлювати на підставі одного результату дослідження. Точний діагноз повинен брати до уваги клінічний анамнез, симптоматику, а також серологічні дані.