MegaELISA® GIARDIA –  імуноферментний аналіз для якісного виявлення Giardia duodenalis у фекаліях кишенькових, домашніх та сільськогосподарських тварин.

Відомо, що лямблії є одним із найпоширеніших кишкових паразитів у кишенькових, домашніх, сільськогосподарських та диких тварин, а також у людей (зоонози) у всьому світі. Вид Giardia duodenalis зустрічається у різних видів тварин та серед людей (генотипи від A до G), які відрізняються за ступенем інфікування та видом хозяїна. Типи A і B мають зоонозний потенціал, тоді як інші є більш-менш специфічними для хозяїна. Найчастіше хворіють новонароджені та молоді тварини. Поширеність серед котів і собак варіює залежно від віку (> 70 % до 1 року), утримання (від 10 % в індивідуальному господарстві до 100 % у розплідниках і притулках для тварин) та імунного статусу. Передача (прямий контакт, через заражену їжу, воду, предмети, догляд за тваринами та переносниками, такими як мухи тощо) відбувається фекально-оральним шляхом, коли людина ковтає високоінфекційні та дуже стійкі цисти, що виділяються іншими тваринами або людьми. Для зараження достатньо лише п’яти-семи цист.

Формування:

Giardia duodenalis має безстатевий життєвий цикл. У дванадцятипалій кишці заражених тварин із інкорпорованих цист (ексцист) формуються дві форми росту, так звані трофозоїти. Вони розмножуються шляхом дублювання, прикріплюються за допомогою присосок до поверхні дванадцятипалої кишки. Вільні трофозоїти перетворюються у свої стійкі форми — інцистити, особливо в клубовій кишці. Вони виводяться у великих кількостях та переважно періодично, тобто не при кожній дефекації. Передпатентний період становить від 5 до 16 днів.

Симптоматика:

Основним симптомом лямбліозу є діарея. Вона може бути більш-менш інтенсивна, може переходити від симптоматичної до безсимптомної. Незалежно від прогресування можуть виникати цисти та/або трофозоїти (переважно при сильній діареї). Відрізнити цисти лямблій від цист різних видів кокцидій можуть тільки досвідчені фахівці- за допомогою мікроскопії. Це так само вірно для трофозоїтів Giardia– та Tritrichomonas fetus. Численні дослідження показують переваги імуноферментного аналізу для якісного виявлення Giardia duodenalis порівняно зі звичайними методами виявлення. Серед яких: мікроскопічний вияв  у фекальному мазку або у модифікованій седиментації чи навіть за допомогою біопсії кишечника.

Система MegaELISA® GIARDIA ідеально підходить як стандартний тест для ветеринарних лабораторій для швидкої та рутинї детекції інтактних цист G. duodenalis, трофозоїтів або продуктів їх розпаду.

MegaELISA® GIARDIA – ІФА тест система за принципом «сендвіча», використовує специфічні антитіла.

Моноклональні антитіла проти специфічних антигенів Giardia зв’язуються з поверхнею лунки ІФА планшета. Суспензія досліджуваного зразка калу, а також внутрішній контроль на першому етапі інкубують при кімнатній температурі (20-25 °C) з біотинільованими антитілами проти лямблій (Кон’югат 1) у лунках планшета ІФА. За наявності антигенів лямблій утворюється «сендвіч-комплекс», що складається з іммобілізованих антитіл, антигену лямблій та біотинільованого антитіла. Після етапу промивання додають кон’югат полі пероксидази стрептавідину (Кон’югат 2) і знову інкубують при кімнатній температурі (20-25 °C).

Незв’язаний кон’югат поліпероксидази стрептавідину видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату зв’язаний фермент перетворює безбарвний розчин у лунках планшета з позитивними зразками на синій розчин.

При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Екстинкція є пропорційна концентрації антигенів лямблій, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ / РЕАГЕНТИ, що постачаються разом з тест-набором

Реактивів однієї упаковки вистачає на 96 визначень.

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

Можна використовувати зразки фекалій кишенькових, домашніх та сільськогосподарських тварин. Необхідно подбати про те, щоб зразки фекалій були зібрані у відповідні транспортні пробірки! Слід уникати контакту зразка фекалій з транспортними середовищем, консервантами, сироватками тварин, іонами металів, окислювачами або миючими засобами, оскільки це може призвести до інтерференції з MegaELISA® GIARDIA. У разі використання ректальних мазків переконайтеся, що маєте достатньо зразка калу для проведення тесту (мінімум 100 мг).

Через зазвичай неоднорідне або локально розповсюдження антигенів у калі, матеріал зразка повинен бути гомогенно перемішаний (шпателем, «Вортексом»).

Для проведення тесту необхідна кількість калу, як описано в розділі « Підготовка зразка» Кількість залежить від консистенції зразка.

Неохолоджений (20-25 °C) зразок повинен бути протестований протягом 4 годин! При температурі 2-8 °C зразок можна зберігати до 3 днів, постійно при температурі не нижче -20 °C. Слід уникати багаторазового розморожування та заморожування. Розморожені зразки повинні бути однорідно перемішані перед розведенням (оптимально за допомогою «Вортекса»).

Під час досліджень великих груп тварин, зразки фекалій клінічно незрозумілих тварин / контактних тварин також слід досліджувати для виявлення безсимптомного носійства.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також всі використані компоненти тест-набору повинні мати кімнатну температуру на момент застосування.
• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

 Змішайте 1 частину концентрату промивного буфера з 9 частинами дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані.

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:11

• Додайте 1 мл (1000 мкл) буфера для розведення зразків (SDB) у відповідну пробірку для зразків.
• Додайте приблизно 100 мкл рідкого калу за допомогою одноразової пластикової піпетки або візьміть приблизно 50-100 мг м’яко-щільних фекалій шпателем або одноразовою петлею для посіву і внесіть зразок в SDB
• Добре гомогенізуйте суміш зразок-буфер (SBM) (повторне перемішування піпеткою або «Вортекс»). Залиште зразок на деякий час для осадження. Частинки сирого калу можуть збиратися/осідати на дні пробірки.
• Надосадову рідину, отриману при цьому, можна безпосередньо використовувати для тесту.
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції супернатант повинен бути вільним від частинок! Щоб це гарантувати, будь ласка, центрифугуйте SBM при 2500 g, 5 хвилин.

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

 Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.

• Додати 100 мкл
• позитивного контролю
• негативного контролю
• розведеного у SBM зразка

кожен у потрібному порядку в певну лунку стрип-смужки.

• Додайте 100 мкл Кон’югату 1 (кон’юговані з біотином антитіла) в кожну лунку та перемішайте суспензію, злегка нахиливши планшет.
• Накрийте планшет та інкубуйте 30 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 5 разів 300 мкл промивного буфера на кожну лунку. Злегка струсіть планшет із промивним буфером, потім видаліть його
• Повністю видаляйте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції (5х 300 мкл)!
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл Кон’югату 2 (кон’югат полі пероксидази стрептавідину) в кожну лунку тест-смужки.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 15 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

  Промийте, як вказано в пункті 8.2.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 15 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.

ВИМІРЮВАННЯ

 Додайте 50 мкл розчину Стоп у кожну порожнину

• Після ретельного перемішування (торкаючись краю лунки) можна виміряти екстинкцію при 450 нм (опціонально: 450 / 620 нм). Нульове регулювання – без планшета ІФА!)

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити чорнуваті осади розчину субстрату.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

ТЕСТ правильний, якщо при довжині хвилі 450 нм ОЩ:

• негативного контролю < 0,2 (450 / 620 нм ОЩ < 0,160)

при 450 нм або 450/620 нм ОЩ:

• позитивного контролю > 0,8

Недостатнє відмивання, коли ОЩ:

• негативного контролю при 450 нм > 0,2 (450 / 620 нм ОЩ > 0,160).

 

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

 РОЗРАХУНОК ЗНАЧЕННЯ ВІДСІКАННЯ

Для визначення значення відсікання до виміряної екстинкції негативного контролю додають 0,15 одиниць екстинкції.

Значення відсікання = екстинкції негативного контролю + 0,15

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

 Позитивний результат тесту

Зразок з екстинкцією більше ніж на 10 % вище за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10 % вище і нижче значення відсікання. Повторний тест через 2-4 тижні з новим зразком, який також є маргінальним, слід оцінювати як негативним!

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• MegaELISA® GIARDIA виявляє антигени Giardia duodenalis у фекаліях кишенькових, домашніх та сільськогосподарських тварин. Взаємозв’язок між величиною виявленого значення та появою або тяжкістю клінічних симптомів не може бути виведений з цього.
• Діагноз інфекційного захворювання не можна встановлювати на підставі одного результату дослідження. Точний діагноз повинен брати до уваги клінічний анамнез, симптоматику, а також серологічні дані.
• Позитивний результат не виключає наявності інших інфекційних агентів.
• Негативний результат не виключає можливого зараження лямбліями. У разі наявної діареї та одноразового негативного результату, необхідно провести нове дослідження з новим зразком калу (оптимально – збір зразків калу: індивідуальне дослідження щонайменше трьох послідовних зразків калу).
• Незначний результат тесту може бути спричинений неоднорідним розподілом лямблій у зразку калу. У цьому випадку слід протестувати другу суспензію з того ж зразка калу або запросити додатковий зразок калу для дослідження.
• Бактеріальне забруднення або повторні цикли заморожування-відтавання зразка можуть вплинути на на значення екстинкції.