MegaELISA® LEISH canine – це імуноферментний аналіз для якісного виявлення антитіл проти Leishmania infantum у плазмі або сироватці собаки.

Вісцеральний лейшманіоз собак викликається протозой Leishmania infantum, поширеною в усьому світі. Собаки та інші собачі вважаються резервуаром лейшманіозу для людей (зооноз).

До цього часу лейшманіоз був відомий у вільних від лейшманії регіонах як хвороба, що виникає під час подорожей. Нові дослідження свідчать про збільшення кількості спорадичних автохтонних випадків лейшманіозу в регіонах, досі вільних від лейшманіозу. Переносники, піщані мухи (Phlebotominae), потребують субтропічного або тропічного клімату, але географічно не залежать від таких кліматичних зон. Існують перші науково підтверджені знахідки піщаної лихоманки в помірних зонах. Крім того, обговорюється інфікування під час спарювання (сеча / сперма), діаплацентарна передача та переливання крові.

Інфікування

Лейшманії переносяться піщаними мухами через укуси. Вони паразитують та розмножуються в макрофагах і клітинах ретикулоендотеліальної системи (зокрема, в печінці, селезінці, кістковому мозку, лімфатичних вузлах). Залежно від зимодеми Leishmania та імунного статусу собаки, спостерігаються різні клінічні симптоми з більшою чи меншою мірою дерматологічних (різні зміни шкіри та кігтів) та вісцеральних (апатія, лихоманка, носова кровотеча, кульгавість, ниркова недостатність) проявів. Через індивідуальний надзвичайно варіабельний інкубаційний період, від кількох місяців до кількох років, заражені тварини можуть бути безсимптомними протягом цього часу. Виявлення антитіл до лейшманій можуть вказувати на початкову або наявну інфекцію. Таким чином, підозрілі тварини та тварини з ендемічних щодо лейшманіозу регіонів повинні бути досліджені серологічно на наявність антитіл повторно з інтервалом у 2-4 тижнів. Тварини з ендемічних районів та безсимптомні тварини можуть показувати низький чи дуженизький титр антитіл (“серопоширеність”), тоді як клінічно хворі тварини демонструють чітке збільшення титру між двома тестами (“поширеність хвороби”). Тому непряме виявлення антитіл за допомогою тест системи MegaELISA® LEISH canine має велике діагностичне значення.

Завдяки своїй високій чутливості та специфічності, тест система MegaELISA® LEISH canine ідеально підходить як тест для ветеринарних лабораторій для швидкого і стандартизованого рутинного виявлення антитіл проти Leishmania infantum в плазмі або сироватці крові собаки.

MegaELISA® LEISH canine – якісний імуноферментний аналіз для виявлення антитіл проти Leishmania infantum за принципом «сендвіча».

Специфічні антигени лейшманій зв’язуються з поверхнею лунки планшета для ІФА. Розведені зразки вносять піпеткою в лунки планшета та інкубують при кімнатній температурі (20-25 °C). Антитіла, присутні в зразку, зв’язуються з антигенами та виявляються на другому етапі за допомогою кон’югату. Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидин [TMБ]), у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює безбарвний розчин у лунках планшета на синій. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Екстинкція пропорційна до концентрації специфічних до лейшманій антитіл, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ / РЕАГЕНТИ, що постачаються разом з тест-набором

Реактивів однієї упаковки вистачає на 48 чи 96 визначень.

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте тільки зразки плазми або сироватки крові собак!
• Неохолоджену (20-25 °C) плазму або сироватку слід тестувати протягом 4 годин! При температурі 2-8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 4 днів. Зразки плазми або сироватки можна аліквотувати та постійно зберігати при температурі -20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• УВАГА: Частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки з ЕДТА, цитратом або гепарином можуть створювати інтерференційні ефекти, що призводять до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також всі використані компоненти тест-набору повинні мати кімнатну температуру на момент застосування.
• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину концентрату промивного буфера з 9 частинами дистильованої води.

Якщо в концентраті промивного буфера з’являться кристали, розчиніть їх, нагрівши концентрат промивного буфера до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер буде стабільним протягом 5 днів, якщо зберігати при кімнатній температурі (20-25 °C).

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:101

• Зразки для тестування розводять 1:101 буфером для розведення зразків (SDB, напр. 5 мкл зразка + 500 мкл SDB) перед початком роботи
• Добре гомогенізуйте суміш зразок-буфер (SBM) (повторне перемішування піпеткою або «Вортекс»).
• УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції супернатант повинен бути вільним від частинок! Щоб це гарантувати, будь ласка, центрифугуйте SBM при 2500 g, 5 хвилин.

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

• Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.
• Додати 50 мкл
• позитивного контролю
• негативного контролю
• Контролю рівня відсікання
• розведеного у SBM зразка

в потрібному порядку в певну лунку тест-смужки. Залиште одну лунку порожньою для субстрату-бланку.

• Накрийте планшет та інкубуйте 60 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 4 разів 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю видаляйте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

 ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції (5х 300 мкл)!
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл Кон’югату в кожну лунку тест-смужки.
• Накрийте його та інкубуйте протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C).

ПРОМИВАННЯ

Промийте, як вказано в пункті “ПРОМИВАННЯ”

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату ТМБ у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.
• Додайте 100 мкл Стоп–розчину в кожну лунку в тому ж порядку і з тією ж швидкістю як і для ТМБ субстрату.

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (обережно нахиляючи планшет) екстинкцію можна виміряти при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується провести додаткове вимірювання при референтній довжині хвилі 620 нм
• Налаштуйте пристрій для читання ІФА планшетів на нуль, використовуючи бланк субстрату. Якщо з технічних причин пристрій для читання ІФА планшетів не може бути налаштований на нуль за допомогою лунки з бланком субстрату, відніміть значення екстинкції в цій лунці від усіх інших значень екстинкції виміряних для отримання достовірних результатів!

УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити появу чорнуватого осаду розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад, 1:1. Потім розведіть зразок 1:100 буфером для розведення зразків і помножте результати в МО на 2.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

РОЗРАХУНОК ЗНАЧЕННЯ ВІДСІКАННЯ

Значення відсікання розраховується як середнє значення двох визначених Контролів рівня відсікання.

Рівень відсікання = (Контролю рівня відсікання Екстинкція 1 + Контролю рівня відсікання Екстинкція 2)/2

Наприклад, (0,39 + 0,37)/2 = 0,76/2 = 0,38; Рівень відсікання = 0,38

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

 Позитивний результат тесту

Зразок з екстинкцією більше ніж на 10 % вище за значення відсікання.

Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в області 10 % вище і нижче значення відсікання. Повторний тест через 2-4 тижні з новим зразком, який також є маргінальним, слід оцінювати як негативним!

 Результат тесту негативний

Зразок із екстинкцією більш ніж на 10% нижче значення відсікання.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• Бактеріальне забруднення або повторні цикли заморожування-відтавання зразка можуть вплинути на на значення екстинкції.
• Гемолітичні, ліпемічні або іктеричні проби не демонструють інтерференції до концентрації 10 мг/мл для гемоглобіну, 5 мг/мл для тригліцеридів і 0,2 мг/мл для білірубіну.
• Не можна виключати перехресні реакції з антитілами проти Trypanosoma cruzi (хвороба Шагаса)
• Діагноз інфекційного захворювання не повинен встановлюватися на основі одного результату тесту. Точний діагноз повинен враховувати клінічний анамнез, симптоми, а також серологічні дані

ЗАХОДИ БЕЗПЕКИ ТА ЗАСТЕРЕЖЕННЯ

• Одягніть захисний одяг (одноразові рукавички) та вимийте руки після завершення процедури тестування.
• Не можна їсти і пити під час тестування.
• Зразок матеріалу та контролі слід розглядати як потенційно інфекційні та утилізувати відповідно разом із використаними компонентами тест-набору.
• Не використовуйте реагенти інших виробників разом з реагентами цього тест-набору.
• Не змішуйте реагенти з різними номерами партій.
• Не міняйте ковпачки окремих реагентів між собою.
• Закрийте флакони одразу після використання, щоб уникнути випаровування та мікробного забруднення.
• Після першого відкриття флакони з реагентами необхідно перевірити на наявність мікробного забруднення перед повторним використанням.
• Промивний буфер, контролі та субстрат містять 0,045 % Proclin® 300 як консервант.
• Розчин субстрату містить перекис водню. Уникайте контакту з очима, шкірою.
• Стоп розчин містить 0,2 М кислоти. Ккислота подразнює очі та шкіру. При попаданні в очі ретельно промити водою та звернутися до лікаря! Тримайте в недоступному для дітей місці.

• УВАГА: Рідкі відходи, що містять стоп-розчин, необхідно нейтралізувати перед додаванням їх у розчин гіпохлориту!
• Використовуйте лише чисті наконечники піпеток, дозатор і лабораторний матеріал.
• Ніколи не піпетуйте ротом.
• Позначте зразок та відповідну пробірку, щоб забезпечити точне призначення.
• Для кожного зразка використовуйте нову пробірку.
• Під час етапів інкубації та промивання лунки мають бути повністю покриті рідиною.
• Щоб уникнути перехресного зараження та хибно завищених результатів тесту, піпеткою внесіть зразки пацієнта та кон’югат у лунки ІФА планшета.
• MegaELISA® LEISH надається лише для використання кваліфікованим персоналом, який знає техніку роботи ІФА.

Необхідно суворо дотримуватися процедури випробування, інформації, заходів безпеки та попереджень, наведених у інструкції. Для використання тест-набору з діагностичним устаткування, метод тестування має бути валідований. Будь-яка зміна зовнішнього вигляду, складу та застосування, а також використання в поєднанні з іншими продуктами, не дозволеними виробником, заборонені. Виробник не несе відповідальності за помилкові результати та пов’язані з цим випадки. Відповідальність за такі зміни несе сам користувач. Не несеться відповідальність за неправдиві результати тесту через невірну візуальну оцінку.