Набір для виділення ДНК з гелю призначений для вилучення та очищення фрагментів ДНК розміром 50 п.н.-10 т.п.н. зі стандартних або легкоплавких агарозних гелів у трис-ацетатному (ТАЕ буфер) або трис-бораті (буфер ТВЕ).

Набір для виділення ДНК з гелю застосовує систему зв’язування ДНК на пластині кремнію спін колонки. Зв’язувальна спроможність до 40 мкг ДНК. Дозволяє відновити ізольовані фрагменти ДНК всього за 20 хвилин, залежно від кількості зразків та обраного протоколу.

Очищена ДНК можна використовувати для: флуоресцентного секвенування ДНК, клонування, маркування, розщеплення рестриктазами без додаткових маніпуляцій.

Характеристика:

Очищена ДНК, має співвідношення А₂₆₀/А₂₈₀=1,7 та 1,9

• Процедура екстракції займає всього 20 хв.;
• Висока ефективність відновлення до 85% (50 п.о.-10 т.п.н.);
• Очищена ДНК не містить: інгібіторів ферментів, РНК або білків, готова для подальшого застосування.

Зберігання:

Усі реагенти можна зберігати при кімнатній температурі до 1 року або при 4°С протягом більш тривалого періоду.

Вміст набору:

*Примітка

• Перед першим використанням набору розведіть промивний буфер PE етанолом (96-100%):

Переконайтеся, що ДНК-ази не вводяться в стерильні розчини набору.
• Переконайтеся, що у “Буфері зв’язування BD” немає осаду. При появі будь-якого осаду, перед використанням, розчин підігрівають до 37 °С протягом 3-5 хв для розчинення осаду та охолоджують до 25°С .

• Під час роботи з “Буфером зв’язування BD” надягайте одноразові рукавички, оскільки він містить гуанідину гідрохлорид.
• Якщо очищена ДНК буде використовуватися безпосередньо для секвенування, свіжий буфер для електрофорезу слід використовувати як для приготування гелю, так і для роботи гелю.
• Усі етапи екстракції слід проводити при кімнатній температурі.
• Усі центрифугування слід проводити за допомогою настільної мікроцентрифуги при >12000 g (10000-14000 об/хв, залежить від типу ротора).

Протокол

1. Для кожного фрагмента ДНК, який потрібно виділити, зважте мікроцентрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл  та запишіть вагу (W1).

2. Виріжте ділянку гелю, що містить фрагмент ДНК, за допомогою чистого скальпеля. Розріжте якомога ближче до ДНК, щоб мінімізувати об’єм гелю. Помістіть зріз гелю у попередньо зважену пробірку об’ємом 1,5 мл та знову зважте. Запишіть масу (W2) та розрахуйте вагу ДНК-агарози (W2-W1).

• Якщо очищений фрагмент буде використовуватися для реакцій клонування, уникайте пошкодження ДНК під впливом ультрафіолету. Мінімізуйте час впливу ультрафіолету до кількох секунд або тримайте зріз гелю на скляній або пластиковій пластині під час УФ-освітлення.

3. Додайте “Буфер зв’язування BD” у співвідношенні: 10 мкл буфера BD / 10 мг зрізу агарозного гелю.
4. Інкубуйте суміш гелю при 50-60°С протягом 7-10 хв., або до повного розчинення зрізу гелю. Перемішуйте пробірку, перевертаючи кожні кілька хвилин, щоб полегшити процес плавлення.

• Перевірте колір розчину. Жовтий колір вказує на оптимальний рН для зв’язування ДНК. Якщо колір розчину червоний, додайте 10 мкл 3 M NaAc (ацетат натрію, pH 5,2) та добре перемішайте. Колір суміші стане жовтим.
• Гелі високої концентрації (>2% агарози) або великі зрізи гелю розчиняються більше 10 хв.

5. Перенесіть розчинену гелеву суміш у спін-колонку та інкубуйте протягом 2 хв., при кімнатній температурі.
• Ви можете переносити двічі, якщо суміш перевищує 700 мкл (максимальний об’єм спінової колонки).

6. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв. Видаліть вміст пробірки для збору.

7. Додайте 500 мкл “Промивний буфер PE”. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв. Видаліть вміст пробірки для збору.
• “Промивний буфер PE” необхідно попередньо розбавити етанолом (96-100%).

8. Повторіть “Крок 7” ще раз.
9. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом додаткових 3 хв, щоб видалити залишковий “Промивний буфер PE”. Видаліть пробірки для збору.
•  Наявність етанолу у зразку ДНК може інгібувати подальші ферментативні реакції. Уникайте залишків етанолу у очищеному розчині ДНК.

10. Помістіть центрифужну спін колонку у чисту мікроцентрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл (не входить у комплект). Піпеткою додайте 30-100 мкл “Буфер для елюювання”  до центру колонки, не торкаючись мембрани. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 хв та центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв.
• Об’єм елюювання менше 10 мкл – не рекомендується. Об’єм елюювання 20-50 мкл істотно не знижує вихід ДНК. 

• Попередньо нагрітий буфер для елюювання до 65°C збільшить вихід ДНК, особливо великих фрагментів.
11. Викиньте спін колонку. Зберігайте очищену ДНК при -20°C.
• Буфер для елюювання можна замінити деіонізованою водою, але рН повинен бути 8,0-8,5.

Кількісне визначення ДНК

Виконайте кількісне визначення ДНК, УФ-поглинання при 260 нм.