Набір для виділення плазмідної ДНК з дріжджів MiniPrep

Ціни відображаються зареєстрованим користувачам

SKU: Д 062 (100 екстракцій) Category:
Набір для виділення плазмідної ДНК з дріжджів MiniPrep призначений для швидкої екстракції високоякісної плазмідної ДНК із культур дріжджів (Saccharomyces cerevisiae). Набір для виділення плазмідної ДНК з дріжджів MiniPrep використовує літиказу для високоефективного ферментативного руйнування стінок дріжджових клітин. Заснован на мембраній технології спін колонки.
Принцип екстракції набору для виділення плазмідної ДНК з дріжджів MiniPrep: частки кремнію селективно зв’язують ДНК при високій концентрації солі та низькому рН, в той час як білок та інші домішки видаляються. Чисту ДНК елююють буфером з низьким вмістом солі або водою. Цей метод є швидшим та легшим у виконанні, ніж інші методи екстракції на органічній основі.
Характеристика:

Очищена ДНК, має співвідношення А260/А280=1,7 та 1,9

• Процедура екстракції займає всього 30 хвилин;
• Очищена ДНК не містить: інгібіторів ферментів, РНК та білків.
Зберігання:
Зберігайте РНКазу А при -20°С, інші реагенти при кімнатній температурі до 1 року. “Розчин I” з РНКазою A стабільний протягом 6 місяців при 4°C. Будь-який осад у “Розчині II” можна розчинити, перед використанням, шляхом інкубації при 37°C .
Важливі примітки
• Додайте увесь наданий розчин РНКази А до “Розчину I”, добре перемішайте.
• Перед першим використанням набору розведіть “Промивний буфер W” етанолом (96-100%):
Набір для виділення плазмідної ДНК з дріжджів
Добре перемішайте. Позначте на етикетці пляшки: “Етанол доданий”.
• Переконайтеся, що ДНК-ази не потратили у стерильні розчини набору.
• Переконайтеся, що у “Розчині II” немає осаду. При появі будь-якого осаду, перед використанням, розчин підігрівають до 37 °С  протягом 3-5 хв та охолоджують до 25°С.
• Одягайте одноразові рукавички під час роботи з “Розчином II”. “Розчин III” та “Промивний буфер PB” містять гуанідину гідрохлорид та інші денатуруючі агенти.
• Усі етапи екстракції слід проводити при кімнатній температурі.
• Усі центрифугування слід проводити за допомогою настільної мікроцентрифуги при температурі >12 000 g (10 000-14 000 об/хв, залежно від типу ротора).
Підготовчі роботи – вирощування дріжджових культур
Виберіть добре ізольовані колонії дріжджів, що ростуть на селективному середовищі, відповідному для штаму та плазміди (наприклад, SD/-Leu, якщо використовується вектор pGADT7).
Закріпіть/розкладіть кожну колонію на селективному середовищі, утворивши квадрат розміром 1 см × 1 см. Інкубуйте при 30°C протягом 3 днів.
Протокол
1. Зібрати 1-5 мл нічної культури (≦5×10 7 клітин дріжджів). Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв. Ретельно видаліть середовище.
2. Ресуспендуйте клітинну гранулу у 300 мкл буфері для літикази. Додати . літикази (50 Од), обережно піпетуючи доки суміш не стане однорідною. Перемішувати на вортексі при 30 °С  протягом 1 години.
• Літиказу необхідно надати користувачеві або придбати (Літіказа 10 Од./мкл). Час інкубації може відрізнятися для різних видів.
3. Центрифугувати при кімнатній температурі протягом 10 хвилин при ~5000 об/хв. Видаліть супернатант.
4. Ресуспендуйте клітини у 250 мкл “Розчину I”. Бактерії слід повністю ресуспендувати шляхом перемішування або піпетування.
• Переконайтеся, що РНКаза А була додана до “Розчину I”.
5. Додайте 250 мкл “Розчину II” та обережно перемішайте, перевертаючи пробірку 4-6 разів, доки суміш лізату не стане повністю однорідною. Не крутити на вортексі.

• Не крутіть, щоб уникнути пошкоджень хромосомної ДНК. Не інкубуйте більше 5 хв, щоб уникнути денатурації суперспіральної плазмідної ДНК.

6. Додайте 350 мкл “Розчину III” та негайно й ретельно перемішайте, перевернувши пробірку 4-6 разів. Не крутити на вортексі.

• Нейтралізований бактеріальний лізат мутний та в’язкий. Центрифугуйте при 12 000 об/хв протягом 10 хв.

7. Перенесіть надосадову рідину в спін-колонку.

• Не перевищуйте 700 мкл за один раз. Уникайте перенесення білого осаду.

8. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв. Видаліть пробірку для збору та її вміст.

• Не додавайте відбілювач у пробірку для збору та її вміст.

9. Додайте 500 мкл “Промивного буфера PB” до спін-колонки. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв та видалити пробірку для збору та її вміст.
10. Додайте 500 мкл “Промивного буфера W” у спін колонку. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв та видалити пробірку для збору та її вміст.

• “Промивний буфер W” необхідно попередньо розбавити етанолом (96-100%).

11. Повторіть Крок № 10 ще раз.
12. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 3 хв, щоб видалити залишки “Промивного буфера”. Видалити пробірку для збору та її вміст.
13. Помістіть центрифужну спін колонку у чисту мікроцентрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл (не входить у комплект) та піпеткою додайте 30-100 мкл “Буфера для елюювання” у центр спін колонки, не торкаючись мембрани. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 хв та центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 2 хв.

• Підігрітий “Буфер для елюювання” до 65°C збільшить вихід ДНК, особливо плазмід або космід > 20 т.п.о.
• Другий етап елюювання дозволить відновити залишкову ДНК з мембрани та збільшити загальний вихід на 10-20%.

14. Викиньте спін колонку. Зберігайте очищену плазмідну ДНК при -20°C .

Кількісне визначення ДНК

Виконайте кількісне визначення ДНК, використовуючи УФ-поглинання при 260 нм.

Related products