Набір для виділення плазмідної ДНК MaxiPrep призначений для швидкого та ефективного великомасштабного приготування високоякісної плазмідної ДНК із трансформованих культур E.coli. Набір для виділення плазмідної ДНК MaxiPrep може відновити 400-1000 мкг плазмідної ДНК із 100 мл бактеріальної культури. Набір використовується для ефективного очищення плазмід та космід будь-якого розміру. Фактичний вихід плазміди та оптимальний об’єм культури залежать від кількості копій плазміди та середовища, що використовується для культивування. Принцип екстракції набору для виділення плазмідної ДНК MaxiPrep: астки кремнію селективно зв’язують ДНК при високій концентрації солі та низькому рН, в той час як білок та інші домішки видаляються. Чисту ДНК елююють буфером з низьким вмістом солі або водою. Цей метод є швидшим та легшим у виконанні, ніж інші методи екстракції на органічній основі.
Характеристика:
Очищена ДНК, має співвідношення А260/А280=1,7 та 1,9
• Очищена ДНК не містить: інгібіторів ферментів, РНК та білків.
Зберігання:
Важливі примітки
• Перед першим використанням набору розведіть “Промивний буфер W” етанолом (96-100%):
• Переконайтеся, що ДНК-ази не потратили у стерильні розчини набору.
• Переконайтеся, що у “Розчині II” немає осаду. При появі будь-якого осаду, перед використанням, розчин підігрівають до 37 °С протягом 3-5 хв та охолоджують до 25°С.
• Одягайте одноразові рукавички під час роботи з “Розчином II”. “Розчин III” та “Промивний буфер PB” містять гуанідину гідрохлорид та інші денатуруючі агенти.
• Усі етапи екстракції слід проводити при кімнатній температурі.
Підготовчі роботи – вирощування дріжджових культур
Виберіть одну колонію зі селективної чашки для інокуляції у LB середовище відповідним антибіотиком. Інкубувати протягом 12-16 годин при 37 °С, струшуючи при 200-250 об/хв. Бактеріальна культура повинна мати щільність клітин приблизно 109 клітин/мл або 1-1,5 при поглинанні 600 нм (A600).
Протокол
1. Зібрати 100 мл (плазміда з високим показником копій) або 250-500 мл (плазміда з низьким рівнем копії). Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 1 хв. Ретельно видаліть середовище.
2. Ресуспендуйте клітини у 7,5 мл “Розчину I”. Бактерії слід повністю ресуспендувати шляхом перемішування або піпетування. Інкубуйте лізат при кімнатній температурі протягом 5-10 хв.
• Переконайтеся, що РНКаза А була додана до “Розчину I”.
3. Додайте 7,5 мл “Розчину II” та обережно перемішайте, перевертаючи пробірку ~ 12 разів. Не крутити на вортерсі. Інкубуйте лізат при кімнатній температурі протягом 3-5 хв.
• Не інкубуйте більше 5 хв.
4. Додайте 10 мл “Розчину III” та негайно й ретельно перемішайте, перевернувши пробірку ~12 разів. Не крутити на вортерсі.
• Щоб уникнути локального осадження залишків бактеріальних клітин, важливо, після додавання “Розчину III”, ретельно та обережно перемішати. Нейтралізований бактеріальний лізат має стати мутним та в’язким.
5. Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 15 хв.
6. Перенесіть надосадову рідину у спін колонку, що постачається. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 5 хв.
• Не перевищуйте 15 мл за один раз. Уникайте перенесення білого осаду.
7. Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 2 хв. Видалити вміст пробірки для збору та помістіть колонку назад у ту ж пробірку.
• Не додавайте відбілювач у пробірку для збору та її вміст.
8. Додайте 10 мл “Промивного буфера PB” у центр спін колонки. Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 2 хв та видалити вміст пробірки для збору . Помістіть спін колонку назад у ту ж пробірку.
9. Додайте 10 мл “Промивного буфера W” у центр спін колонки. Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 2 хв а видалити вміст пробірки для збору. Помістіть колонку назад у ту ж пробірку.
• Промивний буфер W необхідно попередньо розбавити етанолом (96-100%).
10. Повторіть “Крок № 9” ще раз.
11. Центрифугувати при 8000 об/хв протягом 4 хв, щоб видалити залишки промивного буфера. Видалити пробірку для збору та її вміст. Висушіть колонку на повітрі протягом 5 хв.
12. Помістіть спін колонку у чисту пробірку ємністю 50 мл. Піпеткою додайте до центру колонки, не торкаючись мембрани, 1,5-2 мл “Буфер для елюювання”. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 5 хв та центрифугувати при 8000 об/хв протягом 2 хв.
• Підігрітий буфер для елюювання до 65°C збільшить вихід ДНК, особливо плазмід або космід > 20 т.п.о.
• Другий етап елюювання дозволить відновити залишкову ДНК з мембрани та збільшити загальний вихід на 10-20%.
13. Викиньте спін колонку. Зберігайте очищену плазмідну ДНК при -20°C.
Кількісне визначення ДНК
Виконайте кількісне визначення ДНК, використовуючи УФ-поглинання при 260 нм.
