Набір для виділення геномної ДНК з дріжджів для простої та швидкої екстракції геномної ДНК (гДНК) без використання фенолу/хлороформу. Гомогенізація не потрібна, оскільки тканини безпосередньо лізуються протеїназою К. Буферна система оптимізована для селективного зв’язування ДНК з мембраною. Проста процедура центрифугування може повністю видалити домішки, такі як білки, двовалентні катіони та вторинні метаболіти. Чисту геномну ДНК елююють водою або буфером з низьким вмістом солі. Набір підходить для високоякісного очищення геномної ДНК від дріжджів.
Характеристика:
Очищена ДНК, має співвідношення А260/А280=1,7 та 1,9
• Генотипування
• кПЛР/qPCR
• Рестрикція
• Секвенування
• Саузерн-блоттинг
Особливості:
• Процедура займає всього 60 хв;
• 3-35 мкг геномної ДНК з 1-5*107 клітин дріжджів;
• Без етапу екстракції фенолом/хлоформом;
• Очищена ДНК без інгібіторів, РНК або білків
Зберігання:
Протеїназу К зберігати при -20°С, інші реагенти при кімнатній температурі до 1 року. Будь-який осад у “Розчині DS” та “Розчині MS” можна розчинити шляхом інкубації при 37°С перед використанням.
Важливі примітки
• Перед першим використанням набору розведіть “Промивний буфер PE” етанолом (96-100%):
Добре перемішайте. Позначте на етикетці пляшки: “Етанол доданий”.
• Переконайтеся, що ДНК-ази не потратили у стерильні розчини набору.
• Переконайтеся, що у “Розчині DS” та “Розчині MS” немає осаду. При появі будь-якого осаду, перед використанням, розчин підігрівають до 37 °С протягом 3-5 хв та охолоджують до 25°С.
• Одягайте одноразові рукавички під час роботи з “Розчином MS” містить гуанідин гідрохлорид.
• Усі етапи екстракції слід проводити при кімнатній температурі.
• Усі центрифугування слід проводити за допомогою настільної мікроцентрифуги при >12 000 g (10 000-14 000 об/хв, залежно від типу ротора).
Протокол
1. Додайте 1-5 мл дріжджових клітин (не більше 5×107 клітин) у мікроцентрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл. Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв, щоб осадити клітини. Видалити супернатант.
2. Додати 600 мкл літиказного буфера та Літикази (200 Од.), ретельно перемішати шляхом короткого перемішування або перевертання, інкубувати при 30°С протягом 30 хв. Центрифугувати при 5000 об/хв протягом 8-10 хв.Видалити супернатант.
• Літиказу необхідно придбати окремо .
3. Додайте 200 мкл “Розчину DS”. Негайно та ретельно перемішати шляхом короткочасного перемішування або інвертуючий.
• Якщо потрібна геномна ДНК без РНК, додайте 4 мкл РНКази A (100 мг/мл) та інкубуйте 5 хв при кімнатній температурі. РНКазу А можна придбати окремо.
4. Додайте 20 мкл протеїнази К, ретельно перемішайте шляхом короткого перемішування або перевертання. Інкубувати при 55 °С до отримання однорідного розчину (~30 хв).
5. Додайте 220 мкл “Розчину MS”, ретельно перемішайте шляхом короткого перемішування або перевертання. Інкубувати при 65°С протягом 10 хв (перевертаючи кілька разів, щоб отримати однорідний розчин).
6. Додайте 220 мкл етанолу (96–100%) до лізату та ретельно перемішайте шляхом короткого перемішування або перевертання.
7. Перенесіть піпеткою суміш з “Кроку № 6” до спін колонки, поміщену у пробірку для збору 2 мл (в комплекті). Центрифугувати при 12 000 об/хв протягом 1 хв. Видалити вміст пробірки для збору.
• На цьому етапі геномна ДНК адсорбується на силікатній мембрані колонки.
8. Додайте 500 мкл “Промивного буфера PS” та центрифугуйте протягом 1 хв при 12 000 об/хв. Видалити вміст пробірки для збору.
9. Додайте 500 мкл “Промивного буфера PE” та центрифугуйте протягом 1 хв при 12 000 об/хв. Видалити вміст пробірки для збору.
• “Промивний буфер PE” необхідно попередньо розбавити етанолом (96-100%).
10. Повторіть “Крок № 9”.
11. Центрифугувати протягом 3 хв при 12 000 об/хв для висихання мембрани колонки. Видалити вміст пробірки для збору та пробірку.
• Оскільки залишковий етанол може заважати подальшим реакціям, важливо висушити мембрану спін колонки. Цей етап забезпечує відсутність залишкового етанолу під час наступного етапу елюювання. Якщо відбувається перенесення етанолу, спорожніть пробірку для збору, а потім повторно використовуйте її після центрифугування протягом 1 хв при 12 000 об/хв.
12. Помістіть спін колонку у чисту мікроцентрифужну пробірку об’ємом 1,5 мл (не входить у комплект) та нанесіть піпеткою 30-100 мкл “Буфера для елюювання TE” безпосередньо на мембрану. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 хв.
• Буфер для елюювання ТЕ можна замінити деіонізованою водою. Але рН повинен бути 8,0-8,5.
• Підігрітий буфер для елюювання TE до 65°C може збільшити вихід геномної ДНК.
13. Центрифугувати 2 хв при 12 000 об/хв. Пробірка містить очищену ДНК.
Зберігайте ДНК при -20°C.
