Taq – полімераза FS нове покоління полімераз. Володіє високою ефективністю ампліфікації та високою здатністю до швидкої елонгації, як KOD полімерази. Швидкість елонгації становить 3 тис. п.о./хв. Скорочує час ампліфікації на 2/3.
Одиниця активності:
За одну одиницю активноcті приймається кількість ферменту, необхідна для включення 10 нмоль дНТФ у кислотно-нерозчинну фракцію за 30 хвилин при +74°С.
Буфер для зберігання:
20 мМ Трис-НСl (рН 8,0)
100 мМ KCl
0,1% ЄДТА
1 мМ DTT
0,5% Тритон Х-100
0,5% Твін 20
50% водний розчин гліцерину
10 х Taq FS буфер з Mg2+:
200 мМ Трис-НСl (рН 8,8)
100 мМ KCl
100 мМ (NH4)2SO4
16 мМ MgSO4
1% Тритон Х-100
Основний ПЛР протокол:
Протокол служить загальним керівництвом. Час, температура, концентрація ДНК Taq -полімерази, праймери, Mg2+ та кількість матричної ДНК можуть відрізнятися від основного ПЛР протоколу.
1. Приготуйте реакційну суміш у стерильній пробірці. Всі операції необхідно проводити на льоді.
Пропис для Taq FS буфера з Mg2+
Пропис для ПЛР буфера без Mg2+
Кількісні рекомендації щодо ДНК-матриць, 50 мкл реакційної суміші:
2. Перемішайте, осадіть центрифугуванням. Додайте краплю мінерального олії, якщо у ампліфікатора кришка без підігріву.
3. Проведення ПЛР
4. Зразки можуть зберігатися при температурі -20°С до використання.
5. Аналіз продуктів ампліфікації проводиться за допомогою електрофорезу у агарозному гелі та візуалізації фарбуванням бромидом етидія. Використовуйте відповідні маркери молекулярних мас.
- Денатурація може тривати від 1-5 хв. при 95°С, залежно від Г-Ц вмісту матриці.
- Оптимальна температура відпалу на 5оС нижче температури плавління дуплексу ДНК з праймером. Якщо отримані неспецифічні продукти ПЛР, оптимізація температури відпалу може бути виконана шляхом поступового підвищення температури на 1-2°С.
- Кількість циклів залежить від кількості матричної ДНК у реакційній суміші та від очікуваного виходу продукту ПЛР. Для більшості реакцій зазвичай досить 25-35 циклів. При недостатній кількості вихідної матриці може знадобитися 40 циклів.
- Час елонгації може бути збільшено для ампліконів, які будуть у подальшому клоновані у T/A вектори.
Ендодезоксірібонуклеазний контроль:
Не виявлено конверсії ковалентно-замкнутої кільцевої ДНК та пошкодженої ДНК після інкубації Taq -полімерази (10 од.) з 1 мкг pBR322 протягом 4 годин при 37°С та 70°С.
Екзодезоксірібонуклеазий контроль:
Не виявлено деградації лямбда ДНК/HindIII після інкубації Taq -полімерази (10 од.) з 1 мкг pBR322 протягом 4 годин при 37 °С та 70 °С.
Рібонуклеазний контроль:
Не знайдено фон у трихлороцтової кислоти після інкубації Taq -полімерази (10 од.) з 1 мкг E.coli [3H] РНК (40000 cpm/мкг) протягом 4 годин при 37 ° С та 70 °С.
Умови транспортування:
Дозволяється транспортувати при +18 … + 25 оС не більше 3-х діб.
Зберігання:
Всі компоненти при -20оС
Термін придатності:
1 рік
