Тест система MegaELISA® FIV Вірус імунодефіциту котів використовує високоспецифічних, синтетичні білки FIV.

Синдром набутого імунодефіциту кішок, викликаний вірусом імунодефіциту кішок (ВІК), поширений у всьому світі серед котячих. Поширеність може варіюватися в широкому діапазоні залежно від умов утримання. У Німеччині (бродячі кішки, коти з деним вигулом) 2–3%, понад 30% в Італії та 44% в Японії.

Зараження FIV, що містить рідини організму, кров або компоненти крові, зазвичай відбувається парентерально (через укуси, переливання крові, спаровування з подальшим укусом шиї), а також шляхом трансплацентарної та перинатальної передачі в кров здорових кішок. Бродячі коти, із сильною територіальною поведінкою, вважаються «тваринами ризику» зі значно вищим рівнем зараження.

Початкова стадія інфекції (збільшення лімфатичних вузлів, пірексія, нейтропенія тощо) часто залишається непоміченою. Наступний лаг-період зазвичай протікає безсимптомно протягом багатьох років. Перші специфічні симптоми проявляються, від викликаних вторинними симптомами (наприклад, стоматит, пухлинні захворювання, анемія та лейкопенія), меншою мірою самим вірусом (наприклад, неврологічні симптоми, лімфоми).

Через безсимптомну початкову фазу та латентний період, а також через той факт, що майже 95% інфікованих FIV кішок демонструють високий рівень антитіл до FIV через 4 тижні після зараження, детекція антитіл до FIV грає важливу роль для вибору лікування.

MegaELISA® FIV є важливим діагностичним інструментом для діагностичної оцінки клінічних та анамнестичних підозрілих на FIV кішок.

MegaELISA® FIV – імуноферментний аналіз для якісного виявлення антитіл до вірусу імунодефіциту котів (FIV) у плазмі або сироватці крові котів.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

MegaELISA® FIV – якісний імуноферментний аналіз для виявлення антитіл проти вірусу імунодефіциту котів за принципом «сендвіча».

Специфічні антигени ВІК зв’язуються з поверхнею лунки ІФА планшета. Розведені зразки вносять піпеткою в лунки планшета та інкубують при кімнатній температурі (20-25 °C). Антитіла, присутні в зразку, зв’язуються з антигенами та виявляються на другому етапі за допомогою кон’югату. Незв’язаний кон’югат видаляють на наступному етапі промивання. Після додавання субстрату (тетраметилбензидин [TMБ]), у позитивних зразках зв’язаний фермент змінює безбарвний розчин у лунках планшета на синій. При додаванні стоп-розчину колір змінюється з синього на жовтий. Екстинкція пропорційна до концентрації специфічних до ВІК антитіл, присутніх у зразку.

КОМПОНЕНТИ ТЕСТ-НАБОРУ

НЕОБХІДНІ РЕАГЕНТИ / ПРИСТРОЇ, ЯКІ НЕ ВХОДЯТЬ У КОМПЛЕКТ ТЕСТ-СИСТЕМИ

• Дистильована або деіонізована вода
• Одноразові пробірки для зразків
• Лабораторні піпетки (5–100 мкл, 1 мл)
• Вихровий змішувач «Вортекс»
• Фільтрувальний папір
• Мірний циліндр (1000 мл)
• Секундомір
• Станція промивання ІФА планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл)
• Фотометр для ІФА планшетів (450 нм, референс фільтр 620 нм)
• Ємність для утилізації з 0,5 % розчином гіпохлориту

СТІЙКІСТЬ ТА ЗБЕРІГАННЯ

Уникати мікробного забруднення. Після закінчення терміну придатності гарантія якості не надається.

Вийміть необхідну кількість ІФА стрипів, помістіть решту смужок у наданий пакет, закрийте пакет і зберігайте його при 2–8 °C.

Необхідно уникати прямого впливу світла на основу, щоб запобігти розкладанню / автоокисленню / зміні кольору на синій. Якщо колір субстрату змінився на синій, його більше не можна використовувати (функціональна нездатність).

ЗРАЗОК ТЕСТУВАННЯ

• Використовуйте тільки зразки плазми або сироватки крові собак!
• Неохолоджену (20-25 °C) плазму або сироватку слід тестувати протягом 4 годин! При температурі 2-8 °C плазму або сироватку можна зберігати до 4 днів. Зразки плазми або сироватки можна аліквотувати та постійно зберігати при температурі -20 °C. Уникайте повторного заморожування та розморожування.
• Деякі ліпемічні або гемолітичні проби можуть викликати фонове забарвлення. У таких випадках рекомендується повторити тест з більш якісними зразками.
• Пам’ятайте, що зразок, а також всі компоненти тест-набору повинні бути кімнатнії температури
• УВАГА: Частково заповнені та/або недостатньо змішані пробірки з ЕДТА, цитратом або гепарином можуть створювати інтерференційні ефекти, що призводять до різних результатів тесту.

ПІДГОТОВКА ДО ТЕСТУ!

Перед початком тесту уважно прочитайте інструкцію із застосування.

Для достовірності результатів важливо точно дотримуватися інструкції із застосування. Проведіть тестування у встановленому порядку та без зволікання. Використовуйте чисті одноразові наконечники для кожного кроку піпетування.

ЗАГАЛЬНІ ПОПЕРЕДЖЕННЯ

• Майте на увазі, що матеріал зразка, а також всі використані компоненти тест-набору повинні мати кімнатну температуру на момент застосування.
• Вийміть стрип-смужки з пакетів після того, як вони досягнуть кімнатної температури. Щоб уникнути втрат через випаровування, їх бажано накрити.
• Добре перемішайте реагенти безпосередньо перед використанням.
• Після використання як невикористані стрип-смужки (у закритому пластиковому пакеті), так і реагенти слід знову зберігати при температурі 2–8 °C.
• Використані стрип-смужки, не можуть бути використані повторно.
• Не можна використовувати пошкоджені компоненти тест-набору.
• Слід уникати прямого контакту зразків із компонентами тест-набору (перехресна контамінація).
• Слід уникати прямого сонячного випромінювання під час тестування.

ПРИГОТУВАННЯ ПРОМИВНОГО БУФЕРУ 1:10

Змішайте 1 частину (60 мл) концентрату буферу для промивання з 9 частинами (540 мл) дистильованої води. Якщо в концентраті буферу для промивання видно кристали, розчиніть їх, нагріваючи концентрат буферу для промивання до 37 °C на водяній бані. Розведений буфер буде стабільним протягом одного року при зберіганні при температурі 2-8 °C.

ПІДГОТОВКА ЗРАЗКУ / РОЗВЕДЕННЯ ЗРАЗКУ 1:200

• Для тестування плазму та сироватку необхідно розвести 1:200 з SDB, наприклад, 5 мкл зразка + 995 мкл SDB.
• Добре гомогенізувати буферну суміш (SBM) (повторне перемішування піпеткою або вихровою мішалкою).
• УВАГА: Під час використання станції для промивання, SBM повинен бути вільним від частинок! Щоб гарантувати це, будь ласка, центрифугуйте при 5000 об/хв протягом 5 хвилин.
• Для титрування розведення слід починати з 1:200.
• Контролі готові до використання і не потребують розведення

УВАГА: Під час використання промивної ІФА станції супернатант повинен бути вільним від частинок! Щоб це гарантувати, будь ласка, центрифугуйте SBM при 2500 g, 5 хвилин.

ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ

• Перед застосуванням добре перемішайте матеріал зразка (SBM) і проведіть кон’югацію!
• Перед початком роботи слід визначити положення зразків пацієнта і стандартів/контролів
• в мікротитрованому планшеті необхідно визначити на аркуші з результатами, що додається до набору.
• Рекомендується зробити принаймні дві копії.
• Використовуйте чисті наконечники для піпеток для кожного етапу піпетування

ВІДБІР ЗРАЗКА ТА ПЕРША ІНКУБАЦІЯ

• Помістіть необхідну кількість тест-смужок у рамку для утримування.
• Додати 100 мкл
• позитивного контролю (2х)
• негативного контролю (2х)
• розведеного у SBM зразка (2х)

в потрібному порядку в певну лунку тест-смужки.

• Обережно струсіть планшет, накрийте його та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20-25 °C).

ПРОМИВАННЯ – УВАЖНО ДОТРИМУЙТЕСЬ ІНСТРУКЦІЙ!

 ПРОМИВАННЯ У РУЧНОМУ РЕЖИМІ

• Видаліть інкубаційний розчин, виливши його в ємність з гіпохлоритом. Утилізація повинна здійснюватися згідно з нормативними правилами.
• Кілька разів обережно постукайте ІФА планшет об фільтрувальний папір.
• Промийте 4 разів 300 мкл промивного буфера на кожну лунку.
• Повністю видаляйте усю рідину між кожним кроком промивання, а потім обережно протріть кілька разів по сухому невикористаному місці.

ПРОМИВАННЯ У АВТОМАТИЧНОМУ РЕЖИМІ

• УВАГА: SBM, який все ще містить будь-які частинки, слід вручну видалити з лунок, струсивши (небезпека закупорки промивних голок)
• Обирайте вірні налаштуванням промивної станції (300 мкл)!
• Повністю видаляйте рідину після кожного кроку промивання.
• Після останнього етапу промивання обережно, але ретельно витріть пластину на фільтрувальному папері. У порожнинах не повинно бути залишків вологи.

ДРУГА ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл Кон’югату в кожну лунку тест-смужки.
• Обережно струсіть планшет, накрийте його та інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі (20-25 °C).

ПРОМИВАННЯ

  Промийте, як вказано в пункті “ПРОМИВАННЯ”.

ТРЕТЯ ІНКУБАЦІЯ

• Додайте 100 мкл субстрату ТМБ у кожну лунку стрип-смужки.
• Накрийте ІФА планшет та інкубуйте 5 хвилин при кімнатній температурі (20–25 °C) і в темряві.
• Додайте 100 мкл Стоп–розчину в кожну лунку в тому ж порядку і з тією ж швидкістю як і для ТМБ субстрату

ВИМІРЮВАННЯ

• Після ретельного перемішування (обережно нахиляючи планшет) екстинкцію можна виміряти при 450 нм протягом 30 хвилин після додавання стоп-розчину. Рекомендується провести додаткове вимірювання при референтній довжині хвилі 620 нм
• Налаштуйте пристрій для читання ІФА планшетів на нуль, використовуючи бланк субстрату. Якщо з технічних причин пристрій для читання ІФА планшетів не може бути налаштований на нуль за допомогою лунки з бланком субстрату, відніміть значення екстинкції в цій лунці від усіх інших значень екстинкції виміряних для отримання достовірних результатів!
• УВАГА: Сильно позитивні зразки можуть спричинити появу чорнуватого осаду розчину субстрату. Рекомендується попереднє розведення зразка фізіологічним розчином NaCl, наприклад, 1:1. Потім розведіть зразок 1:100 буфером для розведення зразків і помножте результати в МО на 2.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Під час кожного тестування необхідно проводити позитивні та негативні контролі, щоб забезпечити стабільність реагентів, а також правильну процедуру тестування.

Варіація необхідних значень, а також будь-яке помутніння або синє забарвлення безбарвного субстрату перед додаванням у лунки можуть бути натяком на закінчення терміну придатності реагентів.

Перед повторним тестуванням слід переконатися в наступному:

– Стабільність використаних реагентів

– Функціональність використовуваного обладнання (калібрування)

– Візуальний контроль компонентів тест-набору на забруднення або витік; не слід використовувати розчин субстрату з блакитними плямами

РОЗРАХУНОК ЗНАЧЕННЯ ВІДСІКАННЯ

Значення відсікання:

Позитивне відсікання = Екстинкція (негативний контроль) + 0,28

Негативне відсікання = Екстинкція (негативний контроль) + 0,2

 Позитивний результат тесту

Зразок з екстинкцією, вищою за позитивне відсікання.

 Граничний результат тесту

Зразок з екстинкцією в диапазоні між обома відсіченнями. У цьому випадку рекомендується повторити тест через 3-4 тижні з новим зразком. Якщо сероконверсія відсутня, а екстинкція не перевищує позитивну межу відсікання, зразок слід вважати негативним.

 Негативний результат тесту

Зразок з екстинкцією, нижчою за негативне відсікання.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

• Інтерпретація результату тесту завжди повинна ґрунтуватися на анамнестичних і клінічних даних, а також клінічних даних, а також на можливостях терапії та профілактики.

MegaELISA® FIV = НЕГАТИВНИЙ

→ брак ВІК антитіл

• неінфікований кіт
• інфікований кіт на початковій стадії (відсутність наростання титру Ø до 4 тижнів (бл. 95 %), але також до 1 року після зараження)
• кіт в термінальній фазі (недостатня концентрація вироблення антитіл нижче межі виявлення тесту)

MegaELISA® FIV = один позитивний результат

→ наявність антитіл до ВІК

• інфікований, вірусоносійний кіт (> 6 місяців)
• кошеня віком до 6 місяців (материнські антитіла!)

→ титрування зразка

• титр антитіл досліджуваного зразка відповідає найвищому розведенню, при якому виміряна екстинкція перевищує позитивне відсікання.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

• Одягніть захисний одяг (одноразові рукавички) та вимийте руки після завершення процедури тестування.
• Зразок матеріалу та контролі слід розглядати як потенційно інфекційні та утилізувати відповідно разом із використаними компонентами тест-набору.
• Не використовуйте реагенти інших виробників разом з реагентами цього тест-набору.
• Не змішуйте реагенти з різними номерами партій.
• Не міняйте ковпачки окремих реагентів між собою.
• Закрийте флакони одразу після використання, щоб уникнути випаровування та мікробного забруднення.
• Після першого відкриття флакони з реагентами необхідно перевірити на наявність мікробного забруднення перед повторним використанням.
• Розчин субстрату містить перекис водню. Уникайте контакту з очима, шкірою.
• Стоп розчин містить 0,2 М кислоти. Ккислота подразнює очі та шкіру.

При попаданні в очі ретельно промити водою та звернутися до лікаря! Тримайте в недоступному для дітей місці.

• УВАГА: Рідкі відходи, що містять стоп-розчин, необхідно нейтралізувати перед додаванням їх у розчин гіпохлориту!
• Використовуйте лише чисті наконечники піпеток, дозатор і лабораторний матеріал.
• Ніколи не піпетуйте ротом.
• Позначте зразок та відповідну пробірку, щоб забезпечити точне призначення.
• Для кожного зразка використовуйте нову пробірку.
• Під час етапів інкубації та промивання лунки мають бути повністю покриті рідиною.
• Щоб уникнути перехресного зараження та хибно завищених результатів тесту, піпеткою внесіть зразки пацієнта та кон’югат у лунки ІФА планшета.
• MegaELISA® FIV надається лише для використання кваліфікованим персоналом, який знає техніку роботи ІФА.

Необхідно суворо дотримуватися процедури випробування, інформації, заходів безпеки та попереджень, наведених у інструкції. Для використання тест-набору з діагностичним устаткування, метод тестування має бути валідований. Будь-яка зміна зовнішнього вигляду, складу та застосування, а також використання в поєднанні з іншими продуктами, не дозволеними виробником, заборонені. Виробник не несе відповідальності за помилкові результати та пов’язані з цим випадки. Відповідальність за такі зміни несе сам користувач. Не несеться відповідальність за неправдиві результати тесту через невірну візуальну оцінку.